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發(fā)光免疫類檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則
（食藥監(jiān)辦械函[2013]3號）

一、前言

本指導(dǎo)原則主要針對發(fā)光免疫類檢測試劑的主要原材料、生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系、產(chǎn)品質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)提出指導(dǎo)性技術(shù)要求。

本指導(dǎo)原則系對發(fā)光免疫類檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品特性確定其中的具體內(nèi)容是否適用，若不適用，需詳細(xì)闡述其理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。

本指導(dǎo)原則是對申請人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗證資料。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制訂的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善、科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，其相關(guān)內(nèi)容也將進行適時的調(diào)整。

二、適用范圍

該指導(dǎo)原則主要適用于利用發(fā)光免疫分析技術(shù)對蛋白質(zhì)等被測物質(zhì)進行檢測的第三類體外診斷試劑的注冊技術(shù)審查，第二類試劑的生產(chǎn)及質(zhì)量控制可參考該指導(dǎo)原則執(zhí)行

三、基本要求

（一）基本原則

1.研制、生產(chǎn)用的各種原料、輔料應(yīng)當(dāng)制定相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并符合有關(guān)法規(guī)的要求。

2.診斷試劑的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)具備相應(yīng)的專業(yè)技術(shù)人員、儀器設(shè)備以及適宜的生產(chǎn)環(huán)境，獲得《醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證》;同時，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)按照《體外診斷試劑生產(chǎn)實施細(xì)則（試行）》的要求建立相應(yīng)的質(zhì)量管理體系，形成文件和記錄，加以實施并保持有效運行;生產(chǎn)企業(yè)還應(yīng)該通過《體外診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量管理體系考核評定標(biāo)準(zhǔn)（試行）》的考核。企業(yè)應(yīng)對試劑的使用范圍做出明確規(guī)定，并經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)。

3.診斷試劑的研制應(yīng)當(dāng)按照科學(xué)、規(guī)范的原則組織研發(fā)，各反應(yīng)條件的選擇和確定應(yīng)符合基本的科學(xué)原理。

4.研制生產(chǎn)過程中所用的材料及工藝，應(yīng)充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜。

5.試劑生產(chǎn)和質(zhì)量控制的總體目標(biāo)：保證產(chǎn)品使用安全，質(zhì)量穩(wěn)定，工藝可控，使用有效。

（二）原材料質(zhì)量控制

1.主要生物原料

與產(chǎn)品質(zhì)量最密切相關(guān)的生物原料主要包括各種天然抗原、重組抗原、單克隆抗體、多克隆抗體以及多肽類、激素類等生物原科。這類原料可用于包被酶標(biāo)反應(yīng)板、標(biāo)記相關(guān)酶（辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）、中和反應(yīng)用抗原或抗體、制備校準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品）等。一般按工藝要求對這類生物原料進行質(zhì)量檢驗，以保證其達(dá)到規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。主要生物原料若為企業(yè)自己生產(chǎn)，其工藝必須相對穩(wěn)定;若購買，其供應(yīng)商要求相對固定，不能隨意變更供應(yīng)商，如果主要原料（包括工藝）或其供應(yīng)商有變更，應(yīng)依據(jù)國家相關(guān)法規(guī)的要求進行變更申請。

主要生物原料的常規(guī)檢驗項目一般包括：

（1）外觀

肉眼觀察，大部分生物原料為澄清均一的液體，不含異物、渾濁或搖不散的沉淀或顆粒;或者為白色粉末，不含其他顏色雜質(zhì);特殊生物原料應(yīng)具備相應(yīng)外觀標(biāo)準(zhǔn)。

（2）純度和分子量

主要經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，利用電泳掃描儀進行分析，也可用其他適宜的方法，如高效液相法等。根據(jù)所檢測生物原料的分子量選擇適宜聚丙烯酰胺凝膠濃度進行電泳。一般每個電泳道加樣量為5μg，電泳后的凝膠可用考馬斯亮藍(lán)染色或銀染法染色。染色后的凝膠用電泳掃描儀分析原料的純度和分子量，純度應(yīng)達(dá)到相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，分子量大小應(yīng)在正確的條帶位置。

（3）蛋白濃度

蛋白濃度可通過Lowry法、280nm 光吸收法、雙縮脲方法等進行檢測。

（4）效價

效價的測定一般根據(jù)蛋白含量測定結(jié)果，通過倍比稀釋法進行。效價應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求。

（5）功能性實驗

功能性實驗是指生物原料用于試劑盒實際生產(chǎn)中的情況，一般考查使用該原料的試劑盒的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性等，并比較其與上批次原料的相關(guān)性。

2.生物輔料

生物輔料一般指在生產(chǎn)過程中作為蛋白保護劑用途的一類生物原料、主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白等。這些生物原料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合2000年版的《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)要求，并且要適合于本企業(yè)的生產(chǎn)。

建議作以下檢驗：

（1）牛血清或羊血清

外觀：為淺黃色澄清稍粘稠的液體，無溶血或異物

無菌試驗：將血清直接37℃度放置7天，放在明亮處觀察，不得出現(xiàn)混濁或沉淀。

總蛋白含量：用雙縮脲法測定，蛋白含量不小于32mg/ml。

球蛋白含量：取待測血清1ml，采用飽和硫酸銨法進行沉淀，沉淀溶于0.85%氯化鈉溶液，至1ml，用Lowry方法測定，蛋白含量應(yīng)≤2mg/ml。

（2）牛血清白蛋白：

外觀：應(yīng)為淺黃色、黃色或乳白色的凍干粉末，無吸潮，無結(jié)塊，無肉眼可見的其他雜質(zhì)顆粒。

溶解性：將牛血清白蛋白配成10%溶液，在18~26℃時，溶解時間應(yīng)不大于15分鐘。1%牛血清白蛋白水溶液的pH值應(yīng)為6.5~7.1。

總蛋白含量：用雙縮脲方測定，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為≥95%。

總蛋白中的BSA含量：采用硝酸纖維素膜電泳法，其標(biāo)準(zhǔn)為≥95%。

BSA的凈含量：總蛋白含量乘總蛋白中的牛血清白蛋白（BSA）含量，其標(biāo)準(zhǔn)為≥90%。

（3）酪蛋白：

酸度應(yīng)符合生產(chǎn)所需的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

（4）標(biāo)記用酶

應(yīng)在產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中明示所使用的標(biāo)記用酶的名稱（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等），同時應(yīng)根據(jù)不同生產(chǎn)廠家的檢驗方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進行檢驗，酶的純度RZ值（OD_403nm/OD_280nm）應(yīng)大于3.0。

對于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應(yīng)進行功能性實驗，即以其為原料配制一定濃度的稀釋液作為樣品，進行測定，均不得出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。

生物輔料的供應(yīng)商同樣要求相對固定，不得隨意變更供應(yīng)商。

3.化學(xué)原材料

化學(xué)原材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，包括外觀、一般鹽類檢測、溶液pH值、重金屬檢測、溶解情況、干燥失重、熾灼殘渣等，均應(yīng)符合《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)（2000年版）》分析純級別的要求，并且要適合于本企業(yè)的生產(chǎn)。

（1）無機類：主要包括有氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氯鈉等。

（2）有機類：主要包括有吐溫20、三羥基氨基甲烷等。

（3）特殊化學(xué)原料：銪-DTTA，魯米諾等。

銪-DTTA純度分析與鑒定：要求銪-DTTA各功能團符合分子結(jié)構(gòu)，純度在96%以上。

4.其他原輔料

（1）微孔板條

外觀：明亮處用肉眼觀察板條的外觀質(zhì)量應(yīng)無劃痕、破損、飛邊、骯臟、表面光滑。板條與微孔反應(yīng)條塑料框架應(yīng)配合合適。

材質(zhì)：微孔反應(yīng)板條每孔加200μL增強液，用發(fā)光免疫分析儀檢測其熒光值，平均本底熒光值≤1500。

吸附能力和精密性：用一定濃度的蛋白包被微孔板條，檢測熒光值，CV值結(jié)果應(yīng)符合相關(guān)產(chǎn)品的功能性質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，一般批內(nèi)CV≤5%,批間CV≤10%。

（2）其他

粘膠紙、鋁箔袋、說明書、包裝外盒、瓶子和干燥劑等應(yīng)參照國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》和《醫(yī)療器械說明書、標(biāo)簽和包裝標(biāo)識管理規(guī)定》建立相應(yīng)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

（三）試劑盒各組分的生產(chǎn)

發(fā)光免疫分析試劑主要組分的生產(chǎn)包括包被反應(yīng)板、標(biāo)記物制備、各種溶液的配置、凍干、分包裝等步驟;并通過產(chǎn)品的半成品檢驗和成品檢驗兩個質(zhì)控過程來保證其質(zhì)量符合規(guī)定。

1.固相載體的制備（因不同產(chǎn)品使用的包被載體有很大區(qū)別，在此以標(biāo)準(zhǔn)96孔微孔反應(yīng)板為例進行描述）

（1）包被板的準(zhǔn)備

準(zhǔn)備經(jīng)檢驗合格的包被板，記錄批號、數(shù)目、狀態(tài)標(biāo)識。

質(zhì)控項目：尺寸、外觀、包裝。

（2）包被液的配制

配制包被緩沖液，加入包被的抗體或抗原至工作濃度，混合均勻，即成所需的包被液，工作濃度的包被液應(yīng)在規(guī)定時間內(nèi)使用。

質(zhì)控項目：包被緩沖液配方、pH值、包被物成分。

（3）包被板的包被

包被液按工藝要求加入包被板。記錄所包被的包被板數(shù)量。

質(zhì)控項目：包被體積、溫度、時間、過程監(jiān)控。

（4）洗板工作液的配制（按各單位工藝要求，可以不洗板）

按配方配制洗板工作液。

質(zhì)控項目：洗板工作液配方、pH值。

（5）封閉液的配制

按配方配制封閉液。

質(zhì)控項目：封閉液配方、pH值。

（6）洗板和封閉

包被完成后，抽去孔內(nèi)包被液，用洗板工作液洗板后（按各單位工藝要求，可以不洗板），加入封閉液。

質(zhì)控項目：封閉體積、溫度、時間、過程監(jiān)控。

質(zhì)檢項目：封閉前檢驗包被均一性。

（7）抽干

封閉后的反應(yīng)板，抽干孔內(nèi)液體。

質(zhì)控項目：過程監(jiān)控。

（8）干燥

反應(yīng)板應(yīng)按工藝的要求進行干燥。

質(zhì)控項目：溫度、濕度、時間、過程監(jiān)控等。

（9）密封包裝

將干燥后的反應(yīng)板用鋁箔袋密封包裝，內(nèi)放干燥劑（按各單位工藝要求，可以不放）。

質(zhì)控項目：密封性能、標(biāo)示及效期等。

（10）反應(yīng)板（半成品）檢驗

對裝袋密封后的反應(yīng)板進行抽樣檢驗，外觀、板內(nèi)變異、板間變異。

2.滴配過程

（1）酶結(jié)合物的制備（根據(jù)各產(chǎn)品實際情況，該步驟可不進行）

采用常規(guī)過碘酸鈉——乙二醇法將相關(guān)的抗體（或抗原）標(biāo)記辣根過氧化物酶（或其他酶），酶標(biāo)記后的抗體（或抗原）應(yīng)加入適當(dāng)?shù)谋Ｗo劑保存于低溫。

質(zhì)控項目：標(biāo)記方法、過程控制。

（2）酶結(jié)合物的鑒定

①功能性實驗

將酶結(jié)合物用酶稀釋液稀釋后，用于產(chǎn)品的滴配，其結(jié)果應(yīng)符合相關(guān)試劑盒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

② 穩(wěn)定性

將酶結(jié)合物用酶稀釋液稀釋，進行2~8℃熱穩(wěn)定性實驗，滴配結(jié)果應(yīng)符合相關(guān)試劑盒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

（3）酶結(jié)合物稀釋液

按酶結(jié)合物稀釋液的配方配制，存放在2~8℃保存，并于規(guī)定時間內(nèi)使用。

質(zhì)控項目：酶結(jié)合物稀釋液配方、pH值。

（4）酶結(jié)合物工作濃度的滴配

取酶結(jié)合物，用酶結(jié)合物稀釋液稀釋到不同的濃度，用已制備好的反應(yīng)板進行滴配。測定系列標(biāo)準(zhǔn)品及相應(yīng)的質(zhì)控品，確定使體系達(dá)到最優(yōu)的酶結(jié)合物工作濃度。

（5）酶結(jié)合物工作液配制

將所需量酶結(jié)合物和酶結(jié)合物稀釋液按滴配濃度混合均勻。

質(zhì)檢項目：分裝前檢驗，用配套的反應(yīng)板進行檢驗，外觀、靈敏度、質(zhì)控品測定值、定量產(chǎn)品應(yīng)作校準(zhǔn)品線性檢測。

（6）酶結(jié)合物工作液的分裝

按工藝要求分裝酶結(jié)合物工作液。

質(zhì)控項目：分裝前確認(rèn)試劑名稱、批號、數(shù)量，分裝量，封裝后密封性。

（7）酶結(jié)合物工作液（半成品）檢驗

對分裝后的酶結(jié)合物工作液進行抽樣檢驗，外觀、分裝量、靈敏度、校準(zhǔn)品劑量-反應(yīng)曲線線性、質(zhì)控品測定值。

3. 校準(zhǔn)品、陰/陽性對照或質(zhì)控品的制備

（1）稀釋液

按稀釋液的配方配制，存放在2~8℃或-20℃保存，并于有效期內(nèi)使用。

質(zhì)控項目：稀釋液配方、pH值。

（2）校準(zhǔn)品、陰/陽性對照或質(zhì)控品的配制

校準(zhǔn)品、陰/陽性對照或質(zhì)控品的配制應(yīng)具有量值溯源性，可參照國家標(biāo)準(zhǔn)品、世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)品或其他級別的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行配制。

質(zhì)檢項目：分裝前檢驗，準(zhǔn)確性、劑量-反應(yīng)曲線線性（定量產(chǎn)品）、質(zhì)控品測定值。

（3）校準(zhǔn)品、陰/陽性對照或質(zhì)控品的分裝

按工藝要求分裝校準(zhǔn)品、陰/陽性對照或質(zhì)控品。

質(zhì)控項目：分裝前確認(rèn)試劑名稱、批號、數(shù)量，分裝量。

（4）校準(zhǔn)品、陰/陽性對照或質(zhì)控品（半成品）檢驗

對分裝后的校準(zhǔn)品、陰/陽性對照或質(zhì)控品進行抽樣檢驗，外觀、分裝量、準(zhǔn)確性、劑量-反應(yīng)曲線線性（定量產(chǎn)品）、質(zhì)控品測定值。

4.化學(xué)發(fā)光底物的制備

（1）底物緩沖液

按底物緩沖液的配方配制，存放在2~8℃保存，并于有效期內(nèi)使用。

質(zhì)控項目：底物緩沖液配方、pH值。

（2）化學(xué)發(fā)光底物（氧化劑和發(fā)光劑）的配制

分別按氧化劑和發(fā)光劑的配方在底物緩沖液中加入相應(yīng)的氧化劑和發(fā)光劑

質(zhì)控項目：氧化劑和發(fā)光劑配方。

質(zhì)檢項目：分裝前檢驗，本底、發(fā)光強度。

（3）化學(xué)發(fā)光底物（氧化劑和發(fā)光劑）的分裝

按工藝要求分裝化學(xué)發(fā)光底物（氧化劑和發(fā)光劑）。

質(zhì)控項目：分裝前確認(rèn)試劑名稱、批號、數(shù)量，分裝量，封裝后密封性。

（4）化學(xué)發(fā)光底物（半成品）檢驗

對分裝后的化學(xué)發(fā)光底物進行抽樣檢驗，外觀、分裝量、本底、靈敏度、發(fā)光強度。

5.銪標(biāo)記物的制備

針對不同的標(biāo)記生物原料，確定不同的標(biāo)記制備工藝，包括銪-DTTA與標(biāo)記生物原料的比例，標(biāo)記溫度和標(biāo)記時間、標(biāo)記得率的計算標(biāo)準(zhǔn)等。在實際操作過程中要求嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進行操作

6.凍干

各種凍干品都需建立各自的凍干工藝，凍干品外觀應(yīng)該呈現(xiàn)疏松的粉末狀固體，具有一定的形狀，復(fù)溶完全、迅速，呈澄清透明液體。

7.分裝、燈檢和貼簽

分裝量用減重稱量法進行測量，把質(zhì)量換算成體積后進行分裝量的控制。燈檢是目測檢查各組分的色澤、分裝量以及是否混濁、有雜質(zhì)等。

8.包裝

根據(jù)試劑盒包裝標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程及說明書的要求，以流水線操作形式進行包裝。包裝時應(yīng)嚴(yán)格檢查品名、批號、裝量，認(rèn)真核對各物料數(shù)量，并在關(guān)盒前進行復(fù)核。

（四）質(zhì)量控制

1.半成品質(zhì)量控制

（1）半成品抽樣

檢驗人員按試劑的批號，根據(jù)抽樣申請單抽取規(guī)定數(shù)量的半成品各組分，作號標(biāo)記、待檢。

（2）質(zhì)控品的要求

用于半成品質(zhì)量控制的質(zhì)控品包括陰/陽性樣品符合率、靈敏度（最低檢出量）、特異性、檢測范圍、定量曲線的線性、精密性、穩(wěn)定性等指標(biāo)，如具有國家標(biāo)準(zhǔn)品或參考品的產(chǎn)品應(yīng)使用國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）或經(jīng)國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）標(biāo)化的企業(yè)參考品進行檢驗。如無國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品），可采用企業(yè)參考品，企業(yè)參考品的制備應(yīng)有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應(yīng)不低于國家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品的質(zhì)量。

（3）半成品檢驗

根據(jù)各個試劑盒的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或者制檢規(guī)程進行半成品的檢驗，檢驗指標(biāo)一般包括準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性、精密性、相關(guān)性等，均應(yīng)達(dá)到相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

企業(yè)應(yīng)對每一批試劑的半成品進行穩(wěn)定性研究。試劑盒各組分應(yīng)留樣，2~8℃定期作穩(wěn)定性考核，同時作37℃熱穩(wěn)定性試驗，試驗結(jié)果應(yīng)符合產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.成品質(zhì)量控制

（1）成品抽樣

產(chǎn)品包裝完成后，質(zhì)檢人員根據(jù)試劑的批號、實際包裝量、抽樣申請單的要求進行抽樣，同時填寫抽樣數(shù)量和抽樣日期，并且由抽樣人簽名。抽樣數(shù)量應(yīng)包括檢驗用數(shù)量和留樣數(shù)量。質(zhì)檢人員同時應(yīng)檢查相關(guān)原始記錄。

每一批發(fā)光免疫類檢測試劑的試生產(chǎn)量應(yīng)滿足工藝研究、分析性能驗證、穩(wěn)定性研究、臨床試驗、自測及注冊檢驗等各階段所需樣品量的要求。

（2）成品檢驗

一般使用國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）對成品進行檢驗，并達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）的質(zhì)量要求。若該診斷試劑沒有國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品），則使用企業(yè)參考品，企業(yè)參考品的制備應(yīng)有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應(yīng)不低于國家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品的質(zhì)量。

在批放行前，每一批發(fā)光類診斷試劑應(yīng)完成37℃熱穩(wěn)定性試驗，試驗結(jié)果應(yīng)符合產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

四、名詞解釋

發(fā)光免疫類檢測試劑：根據(jù)特異性抗原抗體反應(yīng)等生物學(xué)原理，利用發(fā)光信號的強弱對樣本中相應(yīng)抗原或抗體進行定性或定量檢測的一類試劑。主要包括化學(xué)發(fā)光（酶促、非酶促），電化學(xué)發(fā)光和時間分辨熒光等法。

五、參考文獻(xiàn)

1.《中國生物制品規(guī)程》（2000年版），化學(xué)工業(yè)出版社