國家藥監(jiān)局器審中心關于發(fā)布運動神經(jīng)元存活基因1（SMN1）檢測試劑注冊審查指導原則的通告（2022年第44號）

發(fā)布時間：2022-11-28

為進一步指導運動神經(jīng)元存活基因1（SMN1）檢測試劑的研發(fā)，規(guī)范審評工作，國家藥監(jiān)局器審中心組織制定了《運動神經(jīng)元存活基因1（SMN1）檢測試劑注冊審查指導原則》，現(xiàn)予發(fā)布。

特此通告。

附件：運動神經(jīng)元存活基因1（SMN1）檢測試劑注冊審查指導原則.doc

國家藥品監(jiān)督管理局
醫(yī)療器械技術審評中心
2022年11月28日

附件

運動神經(jīng)元存活基因1（SMN1）檢測試劑
注冊審查指導原則

本指導原則旨在指導注冊申請人對脊髓性肌萎縮癥相關基因運動神經(jīng)元存活基因1（SMN1）檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門提供參考。

本指導原則是對SMN1基因檢測試劑的一般要求，申請人應依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用。若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細化。

本指導原則是供注冊申請人和技術審評人員使用的指導性文件，但不包括審評審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，應在遵循相關法規(guī)的前提下使用本指導原則。如果有能夠滿足相關法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究和驗證資料。

本指導原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標準體系以及當前認知水平下制定，隨著法規(guī)和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發(fā)展，相關內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。

一、適用范圍

本指導原則適用于脊髓性肌萎縮癥（(spinal muscular atrophy，SMA)致病基因運動神經(jīng)元存活基因1（SMN1）第7或第7、第8外顯子拷貝數(shù)變異檢測相關試劑的注冊。預期用途限定為用于SMA的輔助診斷（遺傳診斷）或攜帶者檢測。本指導原則是基于qPCR建立，對于其他檢測技術（如MLPA、數(shù)字PCR、熔解曲線法、測序法及質(zhì)譜法等），可能部分要求不完全適用或本指導原則所述技術指標不夠全面，申請人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對不適用部分補充其他的評價和驗證，但需闡述不適用的理由，并驗證替代方法的科學合理性。

SMA及相關基因的背景信息請見附件。

二、注冊審查要點

（一）監(jiān)管信息

1. 產(chǎn)品名稱及分類編碼

產(chǎn)品名稱應符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》及相關法規(guī)的要求，如運動神經(jīng)元存活基因1（SMN1）檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）。按照《體外診斷試劑分類規(guī)則》，該產(chǎn)品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

2. 申請人還需提交產(chǎn)品列表、關聯(lián)文件、申報前與監(jiān)管機構的聯(lián)系情況和溝通記錄及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預期用途、申報產(chǎn)品上市歷史及其他需說明的內(nèi)容。其中，需注意以下內(nèi)容：

1. 產(chǎn)品描述中應詳述檢測原理、引物探針設計及其與檢測位點的對應關系，選擇依據(jù)以及結(jié)果判斷等。拷貝數(shù)分析建議包括SMN1基因第7外顯子或第7、8外顯子，明確區(qū)分SMN1和SMN2的原理。

2. 與同類和/或前代產(chǎn)品的比較，應著重從方法學、檢驗原理、檢測的基因名稱、檢測靶點、變異類型以及臨床意義等方面詳細說明申報產(chǎn)品與目前市場上已獲批同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別，并明確申報產(chǎn)品優(yōu)勢與患者受益情況。

3. 預期用途需明確適用人群、樣本類型、基因名稱、檢測位點、變異類型及臨床用途。需提交SMA的發(fā)病原因、臨床癥狀、流行病學特征、該疾病相關診斷及有效治療方法，明確現(xiàn)有方法臨床應用的優(yōu)缺點。提交SMA基因型分布的背景資料，明確基因名稱、基因組位置、基因轉(zhuǎn)錄本號。對于拷貝數(shù)變異，需明確檢測靶點、選擇依據(jù)及行業(yè)認可證據(jù)，詳述變異信息、致病作用機制、遺傳模式、變異后果、變異檢出率以及境內(nèi)外人群數(shù)據(jù)等, 提交參考的數(shù)據(jù)庫及支持性文獻等。申請人需根據(jù)產(chǎn)品設計及臨床研究合理聲稱適用人群及預期用途。

綜述資料應符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》和《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》。

（三）非臨床資料

1. 產(chǎn)品技術要求及檢驗報告

1.1 產(chǎn)品技術要求

申請人應當在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、前期評價等結(jié)果，依據(jù)國家標準、行業(yè)標準及有關文獻資料，結(jié)合產(chǎn)品特性按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術要求編寫指導原則》（2022年第8號）的要求編寫指導原則。該類產(chǎn)品作為三類體外診斷試劑，應將主要原材料及生產(chǎn)工藝要求等內(nèi)容作為附錄附于技術要求正文后。

如有適用的國家標準、行業(yè)標準，產(chǎn)品技術要求的相關要求應不低于相應的要求。

1.2 產(chǎn)品檢驗報告

根據(jù)《體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》的要求，申請人應當提供三個不同生產(chǎn)批次產(chǎn)品的檢驗報告，有適用的國家標準品的，應當使用國家標準品對產(chǎn)品進行檢驗。報告形式可為申請人出具的自檢報告或委托有資質(zhì)的醫(yī)療器械檢驗機構出具的檢驗報告。申請人開展自檢的，應當符合《醫(yī)療器械注冊自檢管理規(guī)定》及相關法規(guī)的要求。

2. 分析性能研究

申請人應根據(jù)產(chǎn)品特性提交詳細的分析性能評估資料，包括試驗地點、適用儀器、試劑規(guī)格、批號、試驗方法、試驗樣本（需明確類型、來源、數(shù)量、處理方法、SMN1與SMN2拷貝數(shù)及其確定方法等）、可接受標準、統(tǒng)計方法、試驗數(shù)據(jù)及結(jié)論等，并需對SMN1和SMN2之間的相互影響進行充分評估。分析性能評估的試驗方法可以參考國內(nèi)外有關體外診斷產(chǎn)品性能評估的指導原則。

如試劑用于不同適用機型，需要在不同機型上分別進行性能評估。

每項性能評估應盡量采用與適用樣本類型一致的臨床樣本，并應涵蓋正常人、攜帶者（如適用）及患者的不同樣本。

2.1樣本穩(wěn)定性

樣本穩(wěn)定性一般包括樣本各種實際運輸及儲存（常溫、冷藏和冷凍）條件下的保存期限驗證，以確認樣本的保存條件及保存時間?？梢栽诤侠淼臏囟确秶鷥?nèi)，每間隔一定的時間段即對儲存樣本進行驗證，從而確認不同類型樣本的穩(wěn)定性?？衫鋬霰４娴臉颖具€應對凍融次數(shù)進行合理驗證。

如核酸提取液可保存，還需對核酸提取液的保存條件和保存時間進行研究。

2.2 適用的樣本類型

如果試劑適用于多種樣本類型，應采用合理方法對每種樣本類型及添加劑（如抗凝劑）進行適用性的研究確認。對于不同的樣本類型應分別提交相應的分析性能評估資料。

2.3核酸提取/純化性能

在進行靶核酸檢測前，應有適當?shù)暮怂崽崛?純化步驟。該步驟應最大量分離和純化目的核酸并盡可能去除PCR抑制物。無論檢測試劑是否含有核酸提取/純化組分，申請人都應對配套使用的核酸提取/純化方法的提取效率和提取核酸純度、濃度、檢測限、精密度等進行充分的驗證，并評價該方法能否滿足該類產(chǎn)品的要求。不同樣本類型應分別進行核酸提取/純化性能的研究驗證，并明確提取核酸的質(zhì)量評價標準。

2.4 檢測準確性

建議采用若干份臨床樣本驗證該類產(chǎn)品的檢測準確性，樣本類型與說明書聲稱的樣本類型一致，樣本應涵蓋所有可檢測的基因拷貝數(shù)，建議對低、中、高不同DNA濃度的樣本進行研究。提供所有試驗用樣本來源、型別及拷貝數(shù)確認等試驗資料。

2.5精密度

SMN1精密度評價應至少包含0拷貝、1拷貝及2拷貝SMN1基因的不同臨床樣本，試驗操作完全按照說明書執(zhí)行，包含核酸提取/純化等步驟。應對每一反應體系進行精密度評價。

精密度評價需滿足如下要求：

2.5.1對可能影響檢測精密度的主要因素進行驗證，除檢測試劑本身外，還包括分析儀器、操作者、地點、時間、檢測輪次和試劑批次等。

2.5.2設定合理的精密度評價周期，對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應選擇不同的實驗室進行重復試驗以對室間重復性進行評價。

2.5.3用于精密度評價的臨床樣本至少設置低濃度和中/高濃度水平。

2.5.4精密度指標可設置為CV等（如有），申請人應對精密度指標評價標準做出合理要求。

2.6 檢測限

SMN1 拷貝數(shù)檢測的檢測限包括最高和最低檢測限。

最低檢測限可定義為在滿足一定的檢測準確性和精密度的條件下，能夠檢出目標基因不同拷貝數(shù)的最低人基因組DNA濃度。

最低檢測限的確立：可采用包含不同SMN1拷貝數(shù)的臨床樣本進行研究，對于罕見型別可采用人源性細胞系。對人基因組DNA樣本梯度稀釋，對每個濃度水平重復檢測3～5次，可通過以100%可檢出的最低濃度作為估計檢測限，然后在此濃度附近制備若干濃度梯度樣本，每個濃度至少重復20次檢測，將具有95%檢出率水平濃度作為最低檢測限。

最低檢測限的驗證：應對試劑盒涵蓋的所有的檢測位點進行檢出能力的驗證，至少包括含有0、1、2拷貝SMN1基因第7外顯子或第7、第8外顯子的臨床樣本。

同時，申請人亦應評價產(chǎn)品可準確檢出SMN1不同拷貝數(shù)的人基因組DNA濃度上限，即適當檢出率水平下的最高人基因組DNA濃度，建議采用含有高拷貝SMN2基因的不同SMN1基因型樣本進行最高檢測限的建立和確認研究。樣本要求同最低檢測限評價要求。

應提供所有試驗用樣本來源、型別、樣本濃度及SMN1及SMN2拷貝數(shù)確定的方法等試驗資料。

2.7分析特異性：

分析特異性受干擾和交叉反應的影響。申請人應對樣本中常見的干擾物質(zhì)和可能引起交叉反應的物質(zhì)進行研究。

2.7.1交叉反應：

申請人應針對微生物（如適用）、核酸序列相近或具有同源性、以及其他易引起交叉反應的變異類型序列進行交叉反應研究。申請人應說明交叉反應樣本的來源、制備方法、基因拷貝數(shù)確認方法，提交詳細的驗證資料。同時申請人還應驗證檢測靶序列范圍內(nèi)常見突變位點的交叉干擾。

申請人應對SMN2對SMN1交叉干擾進行研究。應對不同SMN1：SMN2的拷貝數(shù)組合進行充分驗證。如含有高拷貝SMN2（4～5拷貝）的高濃度樣本對SMN1的不同拷貝數(shù)產(chǎn)生的交叉干擾反應（應包括第7外顯子或第7、第8外顯子）。

申請人應提交交叉反應序列的選擇依據(jù)，說明交叉反應樣本的來源/制備方法、核酸序列確認方法，提交詳細的驗證資料。

2.7.2應針對可能的內(nèi)源和外源性干擾物進行干擾試驗研究。內(nèi)源干擾物主要涉及血脂、膽紅素、血紅蛋白和白蛋白，外源干擾物主要包括適用人群血液樣本采集可能用到的抗凝劑、常用藥物及其他可能引入的干擾物質(zhì)等。針對不同樣本類型，建議分別進行相應的干擾研究。

干擾試驗可通過在臨床樣本中人工添加干擾物質(zhì)的方式，評價干擾物質(zhì)對目標序列檢測的影響，也可直接采集暴露于干擾因素后的受試者樣本，進行干擾試驗評價。建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行評價；如有干擾，應確定不產(chǎn)生干擾的最高濃度。

2.8對于采用2-ΔΔCt法的試劑，需提交目的基因和內(nèi)參基因擴增效率一致性研究資料。

3. 穩(wěn)定性研究資料

申報試劑的穩(wěn)定性主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、使用穩(wěn)定性（如開瓶穩(wěn)定性、復溶穩(wěn)定性（如適用）、機載穩(wěn)定性（如適用）等）、運輸穩(wěn)定性、凍融次數(shù)限制（如適用）研究等。申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實施方案、詳細的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。

實時穩(wěn)定性研究應采用至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后，選取多個時間點進行產(chǎn)品性能評價，從而確定產(chǎn)品保存條件和有效期。

4. 陽性判斷值或參考區(qū)間研究資料

建議申請人納入一定數(shù)量的臨床樣本，結(jié)合產(chǎn)品特性可采用受試者工作特征（ROC）曲線或其他合理方法對產(chǎn)品用于結(jié)果判斷的標準/臨界值進行研究確認。樣本應包括來自正常人、攜帶者及患者不同拷貝數(shù)的各種基因型（如至少應包含0、1、2拷貝數(shù)SMN1基因的樣本），申請人應詳細闡述所采用方法的選擇依據(jù)（如權威文獻、行業(yè)共識等），并詳細闡述計算公式和各參數(shù)代表的意義。

應提交詳細研究方案，試驗數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析過程。明確所用樣本類型、樣本來源、樣本量估算的方法、樣本例數(shù)、臨床背景信息、基因型及拷貝數(shù)確認過程及數(shù)據(jù)等信息。

如試劑判讀存在灰區(qū)，應解釋說明灰區(qū)范圍的確定方法?；覅^(qū)的設定應提交理論和實際試驗結(jié)果的依據(jù)，并在說明書【陽性判斷值】和【檢驗結(jié)果的解釋】項進行解釋說明。

5. 其他資料

5.1主要原材料研究資料

主要原材料研究資料包括主要反應成分、對照品/質(zhì)控品及企業(yè)參考品的研究資料。

5.1.1此類產(chǎn)品的主要反應成分一般包括人基因組核酸提取/純化試劑、檢測所需引物、探針、酶、dNTPs等。申請人應提交相關原材料的來源、選擇、制備方法的研究資料，質(zhì)量分析證書，質(zhì)量標準的制定和檢驗資料。如為申請人自制，應提交詳細的工藝穩(wěn)定性研究資料；如為外購，還應提交供應商篩選資料以及供應商提供的原材料質(zhì)量檢定報告。如適用，提交企業(yè)參考品的研究資料，包括來源、組成、陰陽性和/或量值確認等。

5.1.1.1核酸提取/純化試劑（如有）的主要組成、原理介紹及相關的驗證資料。如產(chǎn)品不包含提取試劑，則需明確配套的核酸提取/純化試劑并提交相應的提取效率驗證資料。

5.1.1.2引物、探針

申請人應詳述SMN1及內(nèi)控基因（如適用）引物探針的設計原則、靶基因座位選擇、靶基因信息（基因名稱、參考序列號），同時應提供引物探針核酸序列、模板核酸序列及兩者對應關系。建議設計多套引物探針以供篩選，針對待測位點的準確性、特異性等進行評價，選擇最佳設計，并提交詳細的篩選研究數(shù)據(jù)。

申請人應針對選定的引物探針原材料進行質(zhì)量評價，一般包括：序列準確度、純度（HPLC純等）、濃度、探針熒光標記基團的激發(fā)波長和發(fā)射波長（如適用），以及功能性試驗等，并依據(jù)評價結(jié)果建立合理的質(zhì)量標準。

由于SMN1和SMN2高度同源，只有5個堿基不同，應從產(chǎn)品設計開發(fā)角度詳述如何避免SMN1和SMN2的相互影響。

5.1.1.3酶

酶包括DNA聚合酶和/或尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）等。申請人應針對各種酶的活性進行驗證，提交功能性試驗資料，并確定酶的質(zhì)量標準。如有降低Taq酶非特異性擴增的措施，需詳細描述（例如采用熱啟動酶，Taq抗體等）。

DNA聚合酶應具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具有5’-3’外切酶活性（如適用），具熱穩(wěn)定性。UDG/UNG應具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性。

5.1.1.4脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）

包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP；應提交對其純度、濃度等的驗證資料，以及功能性試驗資料，并確定質(zhì)量標準。

5.1.2對照品/質(zhì)控品

試劑盒應根據(jù)檢測原理設置各種對照品（質(zhì)控品）、質(zhì)控探針（如適用）來實現(xiàn)對產(chǎn)品整個反應體系的有效監(jiān)控。通常至少包括含有0拷貝、1拷貝及2拷貝SMN1第7外顯子或第7、8外顯子的對照品和空白對照?？瞻讓φ諡椴缓泻怂岬娜芤?。

申請人應對管內(nèi)抑制導致的假陰性結(jié)果進行質(zhì)量控制，明確所采取的具體措施（如設置內(nèi)標等）、選擇依據(jù)，并提交相應研究資料。

對照品可采用人基因組DNA、細胞系提取的基因組DNA或質(zhì)粒等。對照品應參與樣本核酸的平行提取。申請人應提供對照品原料選擇、制備、基因序列確認、拷貝數(shù)及濃度確定過程、內(nèi)參基因與靶基因的比例確定等的詳細研究數(shù)據(jù)，并對其檢測結(jié)果做出明確的范圍要求。

產(chǎn)品如涉及用于拷貝數(shù)計算的內(nèi)控基因及對照品, 需提供內(nèi)控基因的選擇依據(jù)、內(nèi)控基因與靶標之間的相互影響、對照品的選擇依據(jù)、原料來源、制備過程、基因拷貝數(shù)確認及DNA濃度確定等的詳細研究資料，并提交質(zhì)量標準建立資料，建議采用臨床樣本或細胞系或其提取的基因組DNA。

5.1.3企業(yè)參考品

SMN1拷貝數(shù)變異檢測試劑的企業(yè)參考品主要包括SMN1純合缺失參考品、SMN1單拷貝參考品、SMN1多拷貝參考品、特異性參考品、檢測限參考品和精密度參考品等，可根據(jù)預期用途的不同，將相應拷貝數(shù)參考品設置為陽性參考品或陰性參考品。設置參考品時應充分考慮SMN1和SMN2之間的相互影響，并至少明確SMN1和SMN2（如適用）拷貝數(shù)。申請人應提交企業(yè)參考品的具體組成、原料來源、選擇、制備方法、基因拷貝數(shù)確認、DNA濃度確認以及檢驗標準的詳細研究資料等。建議采用臨床樣本、臨床樣本提取的基因組DNA或細胞系制備，樣本應明確其來源及型別確認資料。若采用細胞系，如為自制，需提交詳細的細胞系構建資料及確認資料；如為外購，應提供外購商名稱、細胞系名稱、細胞類型、基因型信息及確認資料，并提供外購商提供的質(zhì)檢報告。

5.1.3.1 SMN1純合缺失參考品：應至少包括0拷貝SMN1第7外顯子以及0拷貝SMN1第8外顯子（如包含第8外顯子檢測）的純合缺失型樣本。

5.1.3.2 SMN1單拷貝參考品：主要包括含1拷貝SMN1第7外顯子的雜合缺失型樣本，或含1拷貝第7、第8外顯子（如適用）的雜合缺失型樣本。

5.1.3.3 SMN1多拷貝參考品：應包括含2拷貝及大于2拷貝（如適用）的SMN1第7外顯子或第7、第8外顯子樣本。

5.1.3.4特異性參考品：建議包括高濃度SMN2不同拷貝數(shù)樣本及易產(chǎn)生交叉反應的同源序列樣本。同時應盡量包含檢測范圍外其他檢測位點的樣本等。其中SMN2不同拷貝數(shù)樣本應包括不同的SMN1：SMN2拷貝數(shù)比例，SMN1拷貝數(shù)應包括產(chǎn)品可檢測的拷貝數(shù)范圍，至少包括0拷貝、1拷貝、2拷貝，SMN2基因至少包括4-5拷貝。如涉及納入檢測范圍外其他罕見型別，也可采用質(zhì)粒。

5.1.3.5 檢測限參考品：濃度水平可選擇最低檢測限附近水平，應至少包含可檢測的SMN1第7外顯子或第7、第8外顯子拷貝數(shù)范圍，至少包括0、1、2拷貝。

5.1.3.6精密度參考品應至少包括SMN1拷貝數(shù)為單拷貝（[1+0]）和多拷貝(大于等于2拷貝）的低濃度臨床樣本、臨床樣本提取的人基因組DNA或細胞系。

如有適用于SMN1或SMN2拷貝數(shù)檢測的國家標準品，企業(yè)參考品的要求應不低于國家標準品。

5.2 主要生產(chǎn)工藝及反應體系的研究資料

主要生產(chǎn)工藝研究資料包括工作液配制（引物、探針濃度、酶濃度、dNTPs濃度、緩沖液離子濃度等）、分裝和凍干（如有）、熒光標記（如有）等工藝過程的描述及確定依據(jù)。生產(chǎn)過程應對關鍵參數(shù)進行有效控制，可采用流程圖方式描述生產(chǎn)工藝，標明關鍵工藝質(zhì)控步驟，并詳細說明該步驟的質(zhì)控方法及質(zhì)控標準。

反應體系研究指反應條件的選擇確定過程，包括分析前樣本類型的選擇、樣本采集、預處理（如有）、樣本用量、試劑用量、PCR反應體系及檢測過程中的反應條件/參數(shù)、閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）等的確定，并需明確樣本所需達到的質(zhì)量標準及確定過程。如產(chǎn)品包含核酸分離/純化試劑，應提交對核酸分離/純化過程進行的研究資料。

不同適用機型的反應條件如有差異應分別提交。

（四）臨床評價資料

該類試劑應通過臨床試驗路徑進行臨床評價。臨床試驗應滿足《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》的要求，如相關法規(guī)、文件有更新，臨床試驗應符合更新后的要求。下面僅說明該類產(chǎn)品臨床試驗中應關注的重點問題。

1.針對“脊髓性肌萎縮癥輔助診斷”預期用途

基于目前的產(chǎn)品申報現(xiàn)狀，該預期用途用于檢測SMN1基因的拷貝數(shù)變異，應至少包括第7外顯子的拷貝數(shù)變異，但不包括該基因點突變等其他變異。

1.1臨床試驗機構及人員

申辦者應根據(jù)產(chǎn)品特點及預期用途，綜合不同地區(qū)人種和流行病學背景等因素，選擇不少于3家（含3家）符合法規(guī)要求的臨床試驗機構開展臨床試驗。

1.2臨床試驗適用人群和臨床樣本

該預期用途的適用人群一般包括：具有相關癥狀和/或體征的疑似脊髓性肌萎縮癥患者；需與脊髓性肌萎縮癥進行鑒別診斷的其他疾病患者（如：先天性肌病、先天性及各類肌營養(yǎng)不良、代謝性肌病、重癥肌無力、先天性肌無力綜合征、周圍神經(jīng)病或Prader-willi綜合征等）。

臨床樣本一般為抗凝外周全血樣本。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應分別滿足申報產(chǎn)品說明書、對比方法/對比試劑說明書及第三方試劑說明書（如有）的相關要求。

1.3臨床試驗對比方法

如已有同類產(chǎn)品上市，原則上應選擇已上市同類產(chǎn)品作為對比試劑，對比試劑應涵蓋申報產(chǎn)品的檢測范圍。

1.4最低樣本量和陽性例數(shù)

應采用適當?shù)慕y(tǒng)計學方法估算樣本量，詳細描述所使用統(tǒng)計方法及各參數(shù)的確定依據(jù)。

針對試驗體外診斷試劑檢測性能的驗證，建議采用單組目標值法分別估算每個外顯子的最低樣本量，通過陽性符合率或陰性符合率分別估算陽性和陰性樣本的例數(shù)，同時考慮脫落情況，估算最低樣本總量。陽性符合率和陰性符合率的目標值（臨床可接受的最低標準）均不低于95%。其中，陽性樣本包括拷貝數(shù)為1（雜合型）和0（純合缺失型）的樣本，陰性樣本包括拷貝數(shù)為2（野生純合型）的樣本。綜合考慮統(tǒng)計學要求、臨床流行率及申報產(chǎn)品的技術特點，建議每個外顯子的0拷貝（純合缺失型）樣本應不少于100例。

2.針對“攜帶者檢測”預期用途

基于目前的產(chǎn)品申報現(xiàn)狀，該預期用途用于SMN1基因的拷貝數(shù)變異，應至少包括第7外顯子的拷貝數(shù)變異，但不包括該基因其他點突變等微小變異，且不包括SMN2基因。該預期用途的應用應符合國家及地方衛(wèi)生管理部門的相關規(guī)定。

2.1臨床試驗機構和人員

申辦者應根據(jù)產(chǎn)品特點及預期用途，綜合不同地區(qū)人種和流行病學背景等因素，選擇不少于3家（含3家）符合法規(guī)要求的臨床試驗機構開展臨床試驗。

建議選擇不同地區(qū)的臨床試驗機構開展臨床試驗，且臨床試驗機構應具有相關檢測的優(yōu)勢。臨床試驗操作人員應經(jīng)過相應的培訓，并能熟練操作試驗。機構和人員應遵循《醫(yī)療機構臨床實驗室管理辦法》及其他相關規(guī)定。試驗應處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數(shù)據(jù)的準確性及可重復性。

2.2臨床試驗適用人群和臨床樣本

該預期用途的適用人群為孕前或孕早期人群。

臨床樣本一般為抗凝外周血樣本。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應符合國家衛(wèi)生健康委員會等相關文件的規(guī)定，并滿足相關產(chǎn)品說明書的要求。

2.3最低樣本量和陽性例數(shù)

應根據(jù)臨床評價標準選擇合適的統(tǒng)計學模型，同時結(jié)合適用人群的攜帶率進行樣本量估算，并在臨床試驗方案中明確最低樣本量確定的依據(jù)。建議采用單組目標值法分別估算每個外顯子的最低樣本量，通過陽性符合率估算陽性樣本的例數(shù)，同時結(jié)合攜帶率，并考慮脫落情況，估算最低樣本總量。估算樣本量時，陽性符合率的目標值（臨床可接受的最低標準）不低于95%。

為評估試驗體外診斷試劑的臨床意義和臨床價值，臨床試驗應進行前瞻性研究，并通過前瞻性研究檢出一定數(shù)量的夫妻雙方均為攜帶者的病例。

進行結(jié)果的統(tǒng)計分析時，陰性符合率的點估計值應不低于97%。

2.4臨床試驗方法

建議采用臨床公認的方法（如：MLPA方法等）或已上市同類產(chǎn)品作為對比方法/對比試劑，評價試驗體外診斷試劑的臨床性能。如選擇臨床公認的方法作為對比方法，應對該方法進行嚴格的性能確認，并應嚴格按照建立的方法及相關規(guī)定等進行臨床試驗及質(zhì)量控制。

3.如有其他預期用途，應設計科學的臨床試驗，提供充分的證據(jù)，證明其預期用途。

4.不同預期用途的通用要求

4.1臨床試驗方法、數(shù)據(jù)及統(tǒng)計分析

4.1.1應在臨床試驗方案、小結(jié)和報告中明確試驗體外診斷試劑、對比方法/對比試劑和第三方試劑（如有）的試驗方法。

4.1.2 臨床試驗數(shù)據(jù)表應以列表方式表示，包括試驗體外診斷試劑的結(jié)果、對比方法/對比試劑的結(jié)果、第三方試劑的檢測結(jié)果（如有）、臨床診斷背景信息、年齡和性別等。其中，臨床診斷背景信息為脊髓性肌萎縮癥的病例應明確其實驗室診斷依據(jù)，如：復合雜合突變的檢測結(jié)果等。

4.1.3以交叉表分別總結(jié)兩種方法/試劑的定性檢測結(jié)果，選擇合適的統(tǒng)計方法進行統(tǒng)計分析，以驗證兩種方法/試劑檢測結(jié)果的一致性。同時，統(tǒng)計試驗體外診斷試劑與臨床診斷進行比對時的臨床靈敏度和臨床特異度。

4.1.4 結(jié)果差異樣本的驗證

在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種方法/試劑檢測結(jié)果不一致的樣本，應采用合理方法進行復核，并結(jié)合臨床診斷和實驗室檢測結(jié)果等對差異原因進行充分分析。

4.2臨床試驗方案

各臨床試驗機構的方案設置應基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床試驗機構的實驗室內(nèi)并由該實驗室的技術人員操作完成，申辦者的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉試驗進程。

試驗方案應確定嚴格的入選/排除標準，任何已入選的樣本被排除出臨床試驗都應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程和結(jié)果判定時，應采用盲法以保證試驗結(jié)果的客觀性。各臨床試驗機構選用的對比方法/對比試劑應保持一致，以便進行合理的統(tǒng)計學分析。另外，試驗體外診斷試劑的樣本類型不應超越對比方法/對比試劑對樣本類型的要求。

4.3臨床試驗小結(jié)和報告

應對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進行條理分明的描述，并應包括必要的數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法。

（五）產(chǎn)品說明書

產(chǎn)品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產(chǎn)品說明書格式應滿足《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求（按照現(xiàn)行版本執(zhí)行）。產(chǎn)品說明書的所有內(nèi)容均應與申請人提交的注冊申報資料的相關研究結(jié)果保持一致。如某些內(nèi)容引用自參考文獻，則應以規(guī)范格式對此內(nèi)容進行標注，并單獨列明參考文獻的相關信息。

下面對SMN1基因拷貝數(shù)檢測類產(chǎn)品說明書的重點內(nèi)容進行闡述。

1.【預期用途】應至少包括以下幾部分內(nèi)容：

1.1本產(chǎn)品用于檢測人xx樣本基因組DNA中的SMN1xxx位點的拷貝數(shù)變異，用于xxxx用途。其中xx需明確適用的樣本類型，xxx需明確檢測的位點，xxxx根據(jù)支持的臨床證據(jù)可包括SMA的輔助診斷（遺傳診斷）和攜帶者檢測。

1.2介紹SMA相關的臨床背景信息及實驗室診斷方法等，介紹被測靶標的相關情況。

2. 【檢驗原理】

2.1對試劑盒的被測靶標進行詳細描述（基因組位置、基因的轉(zhuǎn)錄本號，外顯子7及8的相關特征等），對試劑盒所用探針、引物或拷貝數(shù)的判定等進行詳細介紹；對不同樣本反應管組合、內(nèi)參基因設置、對照品（質(zhì)控品）設置及熒光信號檢測原理等進行介紹。

2.2試劑盒技術原理的詳細介紹，建議結(jié)合適當圖示進行說明。如反應體系中添加了相關的防污染組分（如UNG酶），也應對其作用機理進行適當介紹。對區(qū)分SMN2的原理進行詳細描述。如需通過計算對SMN1的拷貝數(shù)進行判斷，應詳述計算原理及公式。

3. 【主要組成成分】

3.1說明試劑盒包含組分的名稱或數(shù)量等信息，說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

3.2試劑盒中不包含但對該項檢測必需的組分，企業(yè)應列出相關試劑/耗材的名稱及其他相關信息。

3.3如果試劑盒中不包含用于核酸提取純化的試劑組分，則應在此注明經(jīng)過驗證后配合使用的商品化核酸提取純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱和醫(yī)療器械備案號（如有）等詳細信息。

4.【儲存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩(wěn)定性等，應明確具體的儲存條件及有效期等信息。

5.【適用儀器】

明確經(jīng)驗證的所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關的重要信息以指導用戶操作。

6. 【樣本要求】

詳述樣本類型的選擇與樣本處理的要求。樣本的采集、處理、運送和保存：明確樣本采集、核酸提取純化前的處理（如離心和洗滌等）、保存條件及期限以及運送條件等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需要恢復至室溫，凍融次數(shù)的限制等。

7.【檢驗方法】

詳細說明試驗操作的各個步驟，包括：

7.1試驗條件：實驗室分區(qū)、試驗環(huán)境的溫度、濕度和空調(diào)氣流方向控制等注意事項。

7.2試劑配制方法和注意事項。

7.3詳述核酸提取純化的條件、步驟及注意事項（如適用），對核酸提取純化環(huán)節(jié)進行合理質(zhì)控，明確提取核酸的濃度純度等質(zhì)量要求。

7.4擴增反應前準備：加樣體積、順序等。

7.5 PCR各階段的溫度、時間設置、循環(huán)數(shù)設置或相應的自動化檢測程序及相關注意事項。

7.6 熔解曲線（如適用）: 各階段溫度、時間設置，升溫速度。

7.7 儀器設置（如適用）：特殊參數(shù)、探針的熒光素標記情況、對待測樣本及其他對照品的熒光通道選擇等。

8.【參考區(qū)間或陽性判斷值】

簡要概述參考區(qū)間或陽性判斷值具體判斷標準及研究驗證情況。需對不同SMN1拷貝數(shù)的參考區(qū)間或陽性判斷值分別進行描述。

9.【檢驗結(jié)果的解釋】

結(jié)合對照品、樣本管、參比樣本檢測結(jié)果以及檢測類型，以列表形式詳述所有可能出現(xiàn)的結(jié)果及相應的解釋。如存在檢測灰區(qū)，應詳述對于灰區(qū)結(jié)果的處理方式。

需明確不同的結(jié)果應進一步采取何種措施，何種情況需進行遺傳咨詢。

僅為生殖腺嵌合體的攜帶者，采用血液細胞檢測可能為陰性結(jié)果。

10.【檢驗方法的局限性】

10.1對產(chǎn)品可檢出及不能檢出的變異類型進行說明。

10.2 產(chǎn)品僅對下述檢測類型xx進行了驗證。

10.3有關假陰性及假陽性結(jié)果的可能性分析。

10.3.1不合理的樣本采集、運送及處理或核酸過度降解均有可能導致假陰性結(jié)果。

10.3.2未經(jīng)驗證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會導致假陰性結(jié)果（如有）。

10.3.3高拷貝SMN2與SMN1之間相互的影響。

10.3.4 SMN1微小突變無法檢出可能導致的假陰性。

10.3.5 由于引物探針結(jié)合位置發(fā)生的多態(tài)性或點突變而可能導致的假陽性。

10.3.6 其他可能引起假陽性或假陰性的情形。

10.4對[2+0]基因型、微小突變及SMN1缺失的低比例嵌合體、檢測范圍外的其他外顯子拷貝數(shù)變異、SMN1-SMN2融合基因等檢出能力的局限性進行說明（如不能檢出）。

10.5有癥狀患者的雜合缺失需要進一步采取合適的方法確認。

10.6本試劑盒的檢測結(jié)果僅供臨床參考，不能單獨作為確診或排除病例的依據(jù)，為達到診斷目的，此檢測結(jié)果要與臨床檢查、病史、連鎖遺傳分析及其他的檢查結(jié)果綜合使用。

11.【產(chǎn)品性能指標】簡述以下性能指標：

11.1對相應國家標準品（如有）檢測的符合情況。

11.2 準確性：簡述研究用樣本、試驗方法和評價結(jié)果。

11.3 最低檢測限：簡單介紹最低檢測限的確定方法，并明確最低檢測限結(jié)果。

11.4精密度：簡單介紹精密度的確定方法，并明確精密度結(jié)果。

11.5 檢測范圍：明確可準確、特異檢測SMN1基因拷貝數(shù)變異的人基因組DNA濃度范圍。

11.6分析特異性：

11.6.1交叉反應驗證：交叉反應驗證情況（包括SMN2基因及其他易產(chǎn)生交叉反應序列的交叉反應等）。

11.6.2干擾物質(zhì)驗證：樣本中常見干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響。

11.7 臨床試驗：簡要介紹臨床試驗樣本、試驗方法、所采用的統(tǒng)計學方法及統(tǒng)計分析結(jié)果。

12.【注意事項】應至少包括以下內(nèi)容：

12.1如該產(chǎn)品含有人源或動物源性物質(zhì)，應給出具有潛在感染性的警告。

12.2臨床實驗室應嚴格按照《醫(yī)療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》現(xiàn)行有效版本等有關分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。

12.3攜帶者檢測前后應進行遺傳咨詢，強調(diào)殘余風險。無論其外周血基因檢測結(jié)果是否提示為攜帶者，再次生育時均應進行產(chǎn)前診斷。

三、參考文獻

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[2] 關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告 [Z].

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[4] 體外診斷試劑說明書編寫指導原則 [Z].

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[8] 趙玉沛名譽主編, 張抒揚主編. 罕見病診療指南(2019年版)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2019.

[9] 國家衛(wèi)生健康委員會、科學技術部、工業(yè)和信息化部、國家藥品監(jiān)督管理局、國家中醫(yī)藥管理局. 第一批罕見病目錄[Z]. 2019.

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背景信息

脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy，SMA)是一組以脊髓前角ɑ-運動神經(jīng)元退化變性導致的肌無力和肌萎縮為主要臨床特征的遺傳性神經(jīng)肌肉病，是兒童最常見的神經(jīng)肌肉病。SMA最常見的形式是由定位于5q13.2的運動神經(jīng)元存活基因1（motor neuron survival gene1，SMN1，OMIM # 600354）致病性變異所導致的5q-SMA，約占所有SMA病例的95%，呈常染色體隱性遺傳。SMA患者臨床表現(xiàn)差異大，從出生前到成人期均可發(fā)病，發(fā)病率約為1/10000-1/6000，攜帶率為1/50-1/40，具有種族差異性。SMA已被列入國家衛(wèi)生健康委員會、科學技術部、工業(yè)和信息化部、國家藥品監(jiān)督管理局、國家中醫(yī)藥管理局聯(lián)合公布的《第一批罕見病目錄》中。

人基因組有兩個高度同源的SMN基因（同源性>99.9%），位于5q13.2端粒側(cè)的SMN1（NG_008691.1）基因和著絲粒側(cè)的SMN2，兩者僅存在5個堿基差異，其中位于第7外顯子第6位c.840的C/T（SMN1為c.840 C，SMN2為c.840 T）導致90%的SMN2 mRNA第7外顯子被選擇性剪接，僅有10%的SMN2表達全長有功能的SMN蛋白。SMN1決定疾病的發(fā)生，而SMN2影響疾病的嚴重程度和進展。

SMN1基因編碼的全長SMN蛋白在各組織細胞廣泛表達，SMN1基因的致病性突變可引起SMN蛋白表達水平下降或功能喪失。在表型正常（包括正常人和攜帶者）的人群中，SMN1基因拷貝數(shù)常為1~4個，正常人基因型包括常見的[1+1]型及罕見的[2+1]型和[2+2]型；攜帶者其中一條染色體含1或2拷貝功能正常的SMN1基因，另一條染色體含缺失或微小變異的功能異常SMN1基因，基因型可為雜合缺失 （[1+0]型、[2+0]型）或雜合突變（[1+1d]和[2+1d]型） （d代表SMN1基因內(nèi)含有微小變異而功能異常，如無義突變、移碼突變、錯義突變等）。

在表型異常的SMA患者中，突變基因型主要有兩類，95%由SMN1雙等位基因純合缺失（[0+0]基因型）所致；5%由SMN1復合雜合突變（[0+1d]基因型）所致，SMN1雙等位基因均為微小變異（[1d+1d]）的情況則非常罕見。SMN1缺失大部分為外顯子7合并外顯子8共同缺失，少部分僅為外顯子7缺失。

SMN2全長mRNA編碼與SMN1相同的SMN蛋白。SMN2的拷貝數(shù)從0到多個不等。SMN2拷貝數(shù)是目前公認的SMA修飾因子，患者攜帶SMN2拷貝數(shù)越多表型越輕，但其與表型的相關性不完全一致，SMN2的序列變異及其他基因也可能影響SMA的表型。因此，SMN2的拷貝數(shù)結(jié)果只能對SMA患病兒童或胎兒的臨床嚴重程度提供一種可能性的參考信息而非確定性結(jié)論。此外對非患者人群不需要進行SMN2的拷貝數(shù)檢測。

臨床疑診為SMA的患者，可選擇基因檢測、血清肌酸激酶（CK）、肌電圖檢查、肌肉病理進行輔助檢查以明確診斷。其中SMN1拷貝數(shù)和致病性變異的檢測結(jié)果用于疾病診斷或排除診斷，若SMN1基因第7外顯子或第7、8外顯子純合缺失，即可診斷為SMN1純合缺失型患者。對于非純合缺失變異，還需對SMN1的致病性微小變異進行分析確認。

SMA攜帶者檢測的靶標至少包括SMN1第7外顯子，當SMN1第7外顯子為1個拷貝數(shù)時，即為SMA攜帶者。SMN2不在攜帶者檢測范圍。

綜上所述，考慮到目前國內(nèi)注冊申報的產(chǎn)品均為SMN1檢測試劑，本指導原則僅對SMN1基因檢測試劑的申報要求進行闡述。基于目前對于SMN1檢測試劑的認知，本指導原則闡述的SMN1檢測的預期用途限定為：用于體外檢測人外周血樣本人基因組DNA中運動神經(jīng)元存活基因1（SMN1）第7或第7、第8外顯子拷貝數(shù)變異，用于SMA的輔助診斷（遺傳診斷）或攜帶者檢測。如申報其他預期用途，申請人可根據(jù)產(chǎn)品具體特性進行評價，適用部分可參考本指導原則。

常用的SMN1基因拷貝數(shù)檢測方法包括多重連接探針擴增（MLPA），定量聚合酶鏈反應法（qPCR）等。MLPA與qPCR方法均不能檢測SMN1微小變異及[2+0]基因型。本指導原則是基于qPCR建立，對于其他檢測技術（如MLPA、數(shù)字PCR、熔解曲線法、測序法及質(zhì)譜法等），可能部分要求不完全適用或本文所述技術指標不夠全面，申請人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對不適用部分補充其他的評價和驗證，但需闡述不適用的理由，并驗證替代方法的科學合理性。