人表皮生長(zhǎng)因子受體2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒(熒光原位雜交法)注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則(2017年第209號(hào))
發(fā)布日期:2017-12-22 閱讀量:次
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人表皮生長(zhǎng)因子受體2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒(熒光原位雜交法)注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則
本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒(熒光原位雜交法)注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫(xiě),同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門(mén)審評(píng)注冊(cè)申報(bào)資料提供參考。
本指導(dǎo)原則是對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒(熒光原位雜交法)的一般要求,申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用,若不適用,需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù),并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。
本指導(dǎo)原則是供申請(qǐng)人和審查人員使用的指導(dǎo)性文件,但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng),亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行,如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法,也可以采用,但需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料,相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。
本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)體系及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的,隨著法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。
一、范圍
人表皮生長(zhǎng)因子受體2(Human Epidermal growth factor Receptor 2,HER2)基因定位于染色體17q12,是表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的成員之一,HER2基因編碼分子量為185kDa的酪氨酸激酶活性跨膜糖蛋白。HER2蛋白主要通過(guò)與家族中其他成員形成異二聚體而與各自的配體結(jié)合;當(dāng)異二聚體與配體結(jié)合后,激活酪氨酸激酶的活性。參與細(xì)胞的增殖、凋亡調(diào)控、血管和淋巴管新生等生物學(xué)功能。HER2蛋白的過(guò)表達(dá)主要是由于HER2基因的擴(kuò)增,可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的異?;罨c腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。HER2基因的擴(kuò)增和蛋白的過(guò)表達(dá)均可稱為HER2陽(yáng)性,該情況出現(xiàn)于部分原發(fā)性浸潤(rùn)性乳腺癌、胃及胃和食管交界處癌(以下統(tǒng)稱胃癌)等患者中。
對(duì)于浸潤(rùn)性乳腺癌適應(yīng)癥,HER2陽(yáng)性是指免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)檢測(cè)結(jié)果為(3+),或原位雜交方法(In situ Hybridization,ISH)檢測(cè)結(jié)果為基因擴(kuò)增。而IHC檢測(cè)結(jié)果為(2+)的病例為不確定,需進(jìn)一步應(yīng)用原位雜交方法進(jìn)行HER2擴(kuò)增狀態(tài)的檢測(cè)。對(duì)于胃癌適應(yīng)癥,HER2陽(yáng)性是指IHC檢測(cè)結(jié)果為HER2(2+)的同時(shí)ISH檢測(cè)結(jié)果為基因擴(kuò)增,或IHC檢測(cè)結(jié)果為HER2(3+)。
對(duì)HER2陽(yáng)性的乳腺癌和胃癌患者進(jìn)行聯(lián)合抗HER2靶向治療(如抗HER2單克隆抗體、小分子酪氨酸激酶抑制劑等)使得部分患者的生存狀況得到改善,但是在HER2陰性的患者中沒(méi)有效果。準(zhǔn)確地檢測(cè)HER2蛋白表達(dá)和基因擴(kuò)增狀態(tài)是抗HER2單克隆抗體分子靶向治療患者篩選和療效預(yù)測(cè)的前提,對(duì)乳腺癌和胃癌的臨床治療和/或預(yù)后判斷至關(guān)重要。對(duì)于浸潤(rùn)性乳腺癌適應(yīng)癥,HER2是患者重要的預(yù)后指標(biāo),也是抗HER2藥物治療的主要預(yù)測(cè)指標(biāo)。對(duì)于胃癌適應(yīng)癥,HER2是晚期胃癌的療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物。
本指導(dǎo)原則適用于采用熒光原位雜交方法檢測(cè)手術(shù)切除樣本和活檢樣本的組織切片中的HER2基因擴(kuò)增情況,包括HER2基因平均拷貝數(shù)(單信號(hào))、HER2基因平均拷貝數(shù)和該基因所在的第17號(hào)染色體著絲粒(CEP17)序列平均拷貝數(shù)的比值(雙信號(hào))。對(duì)于其他應(yīng)用亮視野原位雜交法檢測(cè)HER2基因擴(kuò)增水平的方法,如顯色原位雜交法(Chromogenic In Situ Hybridization,CISH)和銀增強(qiáng)原位雜交法(Silver—enhanced In Situ Hybridization,SISH),可能部分要求不完全適用或本文所述技術(shù)指標(biāo)不夠全面,申請(qǐng)人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)不適用部分進(jìn)行修訂或補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證資料,但需闡述不適用的理由,并驗(yàn)證替代方法的科學(xué)合理性。
本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行首次注冊(cè)申報(bào)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。其他未盡事宜(包括產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)分析資料等),應(yīng)當(dāng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》(國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號(hào),以下簡(jiǎn)稱《辦法》)等相關(guān)法規(guī)要求。
二、注冊(cè)申報(bào)資料要求
(一)綜述資料
綜述資料的撰寫(xiě)應(yīng)符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》(國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號(hào))(以下簡(jiǎn)稱2014年第44號(hào)公告)的相關(guān)要求。內(nèi)容主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說(shuō)明、有關(guān)產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評(píng)價(jià)以及同類產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)外批準(zhǔn)上市的情況介紹等內(nèi)容。重點(diǎn)內(nèi)容要求如下:
1.預(yù)期用途:HER2基因及其家族簡(jiǎn)介,在相關(guān)適應(yīng)癥中的表達(dá)情況,與組織病理學(xué)特征的關(guān)系,其擴(kuò)增情況與乳腺癌和胃癌治療方案制定以及預(yù)后判斷的關(guān)系等。
2.產(chǎn)品描述:熒光原位雜交法(Fluorescence In Situ Hybridization,F(xiàn)ISH)的技術(shù)原理,目標(biāo)基因的座位區(qū)域,探針的設(shè)計(jì)原則以及標(biāo)記的熒光染料,細(xì)胞核復(fù)染方式,以及結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)和統(tǒng)計(jì)方式等。
3.同類產(chǎn)品上市情況:與相同或相似方法學(xué)(如IHC、其他原位雜交方法等)的產(chǎn)品在性能、上市情況和結(jié)果判讀等方面的比較。
(二)主要原材料研究資料
申請(qǐng)人應(yīng)驗(yàn)證主要原材料的性能指標(biāo)符合產(chǎn)品研發(fā)、生產(chǎn)和檢驗(yàn)要求,以確定設(shè)計(jì)要求或者外購(gòu)廠家,并制定主要原材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
1.探針:根據(jù)不同用途,分為基因特異性探針(HER2)和著絲粒探針(CEP17)兩種類型。探針可選擇細(xì)菌人工染色體(BAC)克隆或者聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)等方法進(jìn)行制備。下述內(nèi)容是對(duì)于探針制備通用要求的舉例,如有其他替代方法,應(yīng)詳細(xì)闡述其科學(xué)合理性。
1.1基因特異性探針
1.1.1探針序列的確定:包括探針?biāo)诨虻奈恢脜^(qū)域,人類基因組文庫(kù)的篩選、比對(duì)和特征確認(rèn)過(guò)程。
1.1.2人類基因組文庫(kù)克隆的鑒定:一般檢測(cè)與基因區(qū)域相關(guān)的序列標(biāo)記位點(diǎn)(STS)的存在情況,包括引物的設(shè)計(jì),PCR過(guò)程和產(chǎn)物的電泳圖譜。
1.1.3探針的標(biāo)記:一般為酶促反應(yīng)或者化學(xué)合成方法,應(yīng)詳述標(biāo)記方式的選擇、反應(yīng)體系和過(guò)程、產(chǎn)物的純化方式等。
1.2著絲粒探針:包括微衛(wèi)星重復(fù)單元的序列,PCR引物的設(shè)計(jì)和選擇,熒光染料標(biāo)記的反應(yīng)體系、過(guò)程和產(chǎn)物的純化方式等。
1.3探針的質(zhì)量控制:性能指標(biāo)一般包括濃度、純度、Tm值(如適用)、雜交效率、特異性等,可使用測(cè)定260nm處紫外吸收峰值、測(cè)定260nm與280nm處紫外吸收峰值的比值、瓊脂糖凝膠電泳、染色體分散良好的中期相分裂細(xì)胞雜交驗(yàn)證等方式。
2.熒光染料:技術(shù)指標(biāo)包括最大發(fā)射/吸收峰,與目的核酸片段的結(jié)合能力,持續(xù)被激發(fā)光源照射時(shí)的抗淬滅能力等。
3.雜交緩沖液:應(yīng)描述組成配方,說(shuō)明各成分的作用。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括pH值、鹽離子濃度、甲酰胺濃度、硫酸葡聚糖濃度等。
4.人Cot-1 DNA(如適用):是由大量人類基因組重復(fù)序列組成的高濃度DNA,能封閉樣品中的DNA重復(fù)序列,降低檢測(cè)背景。要求能有效封閉背景信號(hào),避免由于非特異性雜交而影響檢測(cè)結(jié)果的判讀。應(yīng)評(píng)價(jià)人Cot-1 DNA對(duì)樣本檢測(cè)背景信號(hào)的封閉效果,方法可選擇通過(guò)觀察背景強(qiáng)度以及非特異雜交的強(qiáng)度而確定人 Cot-1 DNA的用量。如有其他清除背景信號(hào)的方法,應(yīng)充分說(shuō)明其科學(xué)合理性。
5.二脒基苯基吲哚(DAPI)復(fù)染劑:評(píng)價(jià)指標(biāo)包括對(duì)細(xì)胞核的染色能力以及抗淬滅能力等。
6.企業(yè)參考品:應(yīng)包含陰性參考品、陽(yáng)性參考品和特異性參考品,并詳細(xì)說(shuō)明參考品的來(lái)源、組成、制備和保存情況。陽(yáng)性參考品可選擇經(jīng)已上市產(chǎn)品確認(rèn)HER2基因擴(kuò)增的乳腺浸潤(rùn)癌/胃癌組織,或者人乳腺癌/胃癌細(xì)胞株。陰性參考品可選擇經(jīng)已上市產(chǎn)品確認(rèn)HER2基因無(wú)擴(kuò)增的腫瘤組織,或者腫瘤細(xì)胞株。特異性參考品可選擇健康人外周血培養(yǎng)細(xì)胞,應(yīng)含有較多染色體分散良好的中期分裂相淋巴細(xì)胞。
7.質(zhì)控片(如有):可作為試劑盒的組分或者單獨(dú)配置,包含陰性質(zhì)控片、臨界值質(zhì)控片和/或陽(yáng)性質(zhì)控片。可選擇臨床組織樣本或者HER2擴(kuò)增狀態(tài)確定的細(xì)胞株。
(三)主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料
申請(qǐng)人應(yīng)描述主要生產(chǎn)工藝及確定依據(jù),詳述工序流程以及各個(gè)步驟的質(zhì)量關(guān)鍵控制點(diǎn)。
申請(qǐng)人應(yīng)建立適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)體系,以平衡最佳檢測(cè)信號(hào)和背景強(qiáng)度的關(guān)系。反應(yīng)過(guò)程包括樣本預(yù)處理和雜交檢測(cè)兩個(gè)步驟,其中樣本預(yù)處理過(guò)程一般包括樣本脫蠟、樣本預(yù)處理、蛋白酶處理三個(gè)環(huán)節(jié),雜交檢測(cè)過(guò)程一般包括變性、雜交、雜交后洗滌、DAPI復(fù)染四個(gè)環(huán)節(jié)。另外,應(yīng)合理控制樣本的質(zhì)量并明確要求。
1.樣本的采集、固定、制片、保存和運(yùn)輸:應(yīng)對(duì)采樣部位及方法、樣本中腫瘤組織的含量、離體到固定的溫度及時(shí)間、固定溫度及時(shí)間、保存和運(yùn)輸?shù)臈l件和時(shí)間進(jìn)行研究或者驗(yàn)證,結(jié)合組織形態(tài)及病理學(xué)特征,保證樣本的準(zhǔn)確性以及其中DNA的完整性。另外,切片質(zhì)量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的判讀十分重要,應(yīng)對(duì)切片厚度進(jìn)行研究或者驗(yàn)證,要求計(jì)數(shù)區(qū)域的細(xì)胞胞核邊界完整、DAPI染色均一、細(xì)胞核無(wú)重疊、熒光信號(hào)清晰。不同類型的樣本應(yīng)分別驗(yàn)證。具體可參考國(guó)際或國(guó)內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程;如與標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程有差異,應(yīng)進(jìn)行充分研究。
2.樣本預(yù)處理:應(yīng)對(duì)脫蠟條件、預(yù)處理溫度及時(shí)間、特定鹽溶液的離子強(qiáng)度、蛋白酶的消化條件進(jìn)行充分研究,以避免處理過(guò)程中組織和DNA的損失造成檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性。如其中預(yù)處理過(guò)程可選擇多個(gè)溫度/時(shí)間的組合,蛋白酶消化過(guò)程可選擇多個(gè)持續(xù)時(shí)間進(jìn)行研究。溫度/時(shí)間的組合是指首先在同一時(shí)期的幾個(gè)不同溫度下進(jìn)行,然后在優(yōu)化溫度條件下的幾個(gè)不同持續(xù)時(shí)間進(jìn)行。
3.樣本變性條件:應(yīng)對(duì)樣本變性處理的溫度、持續(xù)時(shí)間的組合進(jìn)行充分研究,以保證樣本中DNA雙鏈的充分解鏈,有利于后續(xù)探針和樣本的結(jié)合,提高雜交效率以及保證雜交的特異性。如選擇多個(gè)溫度/時(shí)間的組合進(jìn)行研究。
4.樣本雜交條件:應(yīng)對(duì)樣本雜交步驟的溫度、持續(xù)時(shí)間的組合進(jìn)行充分研究,以達(dá)到探針和樣本的最佳結(jié)合效率。如選擇多個(gè)溫度/時(shí)間的組合進(jìn)行研究。
5.雜交后洗滌條件:應(yīng)對(duì)緩沖液的鹽濃度和去垢劑成分,以及清洗溫度、時(shí)間、次數(shù)的組合進(jìn)行充分研究,以達(dá)到最佳的雜交嚴(yán)格度。要求盡可能去除樣本中的核蛋白等干擾物質(zhì),避免非特異性雜交,降低背景干擾,并且增加目標(biāo)信號(hào)的強(qiáng)度。如選擇多個(gè)緩沖液濃度以及多個(gè)清洗條件的組合進(jìn)行研究。
(四)分析性能評(píng)估資料
申請(qǐng)人應(yīng)使用多批產(chǎn)品進(jìn)行研究,建立穩(wěn)定可靠的性能指標(biāo)。需提交在產(chǎn)品研制和成品驗(yàn)證階段對(duì)試劑盒進(jìn)行的所有性能評(píng)價(jià)的研究資料,包括方案設(shè)計(jì)、研究方法、材料和設(shè)備、驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)、試驗(yàn)數(shù)據(jù)(包括代表性彩色圖片)和結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析等詳細(xì)資料。建議著重對(duì)以下性能指標(biāo)進(jìn)行研究:
1.靈敏度
主要反映產(chǎn)品檢測(cè)時(shí)探針與目標(biāo)基因位點(diǎn)的結(jié)合效率,也稱為雜交效率。由于組織固定時(shí)蛋白質(zhì)和核酸產(chǎn)生的分子間交聯(lián)等對(duì)靶核酸具有屏蔽作用,探針穿透細(xì)胞的能力不同,導(dǎo)致產(chǎn)品對(duì)于不同類型樣本的雜交效率存在性能差異;應(yīng)使用臨床應(yīng)用環(huán)境中所有可能的樣本類型中具有代表性的類型進(jìn)行評(píng)估。方法可選擇20個(gè)乳腺浸潤(rùn)癌/胃癌病例的組織樣本,以及20個(gè)癌旁正常組織或者良性疾病組織樣本;對(duì)同樣數(shù)量的細(xì)胞隨機(jī)進(jìn)行分析計(jì)數(shù)。每例組織樣本應(yīng)至少檢測(cè)20個(gè)細(xì)胞,分析統(tǒng)計(jì)HER2基因熒光信號(hào)數(shù)量,或者同時(shí)顯示HER2基因位點(diǎn)標(biāo)記和第17號(hào)染色體著絲粒(CEP17)位點(diǎn)標(biāo)記的熒光信號(hào)的細(xì)胞占全部細(xì)胞的比例。
2.特異性
主要反映HER2和CEP17探針對(duì)目標(biāo)序列識(shí)別的特異性。建議使用中期分裂相的外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行涂片分析。選擇5份以上正常人的外周血培養(yǎng)細(xì)胞涂片樣本,每例樣本應(yīng)至少檢測(cè)20個(gè)染色體分散良好的中期分裂相細(xì)胞,對(duì)至少200個(gè)靶位點(diǎn)進(jìn)行分析計(jì)數(shù);結(jié)合染色體G顯帶分析,統(tǒng)計(jì)細(xì)胞核染色體上正確位點(diǎn)的雜交信號(hào)占全部雜交信號(hào)的比例。應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)識(shí)別信號(hào)位點(diǎn),例如染色體形態(tài)學(xué)分析、染色體區(qū)段染色、反向DAPI條帶等技術(shù);考察在HER2基因位點(diǎn)(17q11.2-q12)和/或第17號(hào)染色體著絲粒位點(diǎn)(17q11.2-q11.1)的特定熒光信號(hào)占全部熒光信號(hào)的比例。
3.陰、陽(yáng)性符合率
主要反映產(chǎn)品對(duì)不同類型樣本中HER2基因的檢出能力和準(zhǔn)確性。應(yīng)使用臨床應(yīng)用環(huán)境中所有可能的樣本類型中具有代表性的組織類型進(jìn)行評(píng)價(jià),并提供樣本來(lái)源、唯一可溯源編號(hào)、病理組織類型,以及明確的HER2基因擴(kuò)增狀態(tài)。對(duì)于適應(yīng)癥為乳腺癌的情況,用于評(píng)價(jià)的樣本類型應(yīng)包括乳腺浸潤(rùn)性癌非特殊類型、乳腺浸潤(rùn)性小葉癌、小管癌、粘液癌,良性疾病(如腺病及纖維腺瘤)以及正常乳腺組織等。對(duì)于適應(yīng)癥為胃癌的情況,用于評(píng)價(jià)的樣本類型應(yīng)包括腸型、彌漫型、混合型(Lauren分型)胃癌,良性疾?。ㄈ缥刚衬ぢ匝装Y)以及正常胃組織等。每種組織類型設(shè)置2至3例樣本進(jìn)行評(píng)價(jià)。建議著重評(píng)價(jià)申報(bào)產(chǎn)品對(duì)IHC檢測(cè)結(jié)果為HER2(2+)樣本的HER2基因擴(kuò)增狀態(tài)的檢測(cè)能力。
4.精密度
申請(qǐng)人應(yīng)充分考慮到配套檢測(cè)系統(tǒng)以及使用環(huán)境的因素:包括熒光顯微鏡的特征、激發(fā)光源及過(guò)濾器的性能參數(shù)、物鏡放大倍數(shù)等,以及不同時(shí)間、地點(diǎn)、操作人員、檢測(cè)次數(shù)對(duì)結(jié)果判讀的影響;對(duì)可能導(dǎo)致檢測(cè)之間差異的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證。用于精密度評(píng)價(jià)的參考品應(yīng)選擇HER2擴(kuò)增、HER2無(wú)擴(kuò)增以及臨界值的連續(xù)切片組織樣本。其中臨界值樣本和成簇?cái)U(kuò)增的樣本應(yīng)分別設(shè)置驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)(標(biāo)準(zhǔn)差以及變異系數(shù)的范圍)。建議參考下述方法進(jìn)行各個(gè)指標(biāo)的評(píng)價(jià):
4.1批內(nèi)精密度:由同一操作人員使用同一批次產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè),每例樣本重復(fù)檢測(cè)多次,對(duì)結(jié)果判讀的一致性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
4.2批間精密度:由同一操作人員使用多個(gè)批次產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè),每例樣本重復(fù)檢測(cè)多次,對(duì)結(jié)果判讀的一致性進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。
4.3日間精密度:在多個(gè)不同日期,由同一操作人員使用同一批次產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè),對(duì)結(jié)果判讀的一致性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
4.4人員間精密度:由數(shù)位操作人員使用同一批次產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè),每份樣本由數(shù)位閱片人員進(jìn)行獨(dú)立結(jié)果判讀。對(duì)不同操作人員/閱片人員對(duì)同一例組織樣本檢驗(yàn)方法以及結(jié)果判讀的一致性進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。
4.5室間精密度:建議申請(qǐng)人選擇不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)間一致性的評(píng)價(jià)。
(五)陽(yáng)性判斷值確定資料
HER2檢測(cè)結(jié)果的判讀標(biāo)準(zhǔn)不斷進(jìn)行著更新,申請(qǐng)人應(yīng)參考最新版臨床指南性文件建立陽(yáng)性判斷值。應(yīng)提交申報(bào)產(chǎn)品判讀規(guī)則以及預(yù)設(shè)陽(yáng)性判斷值所依據(jù)的文獻(xiàn)資料,并采用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義數(shù)量的樣本對(duì)判讀規(guī)則以及預(yù)設(shè)陽(yáng)性判斷值進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)包含HER2擴(kuò)增、HER2無(wú)擴(kuò)增以及一定數(shù)量的臨界值(陽(yáng)性判斷值附近)組織樣本,包括HER2/CEP17熒光信號(hào)總數(shù)比值在2附近(1.8~2.2),或者每個(gè)細(xì)胞的平均HER2拷貝數(shù)在4~6附近的樣本。
首先設(shè)定檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性較好的目標(biāo),即HER2平均拷貝數(shù)或者HER2平均拷貝數(shù)/CEP17平均拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差/變異系數(shù)范圍驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn),確定初始統(tǒng)計(jì)細(xì)胞區(qū)域和數(shù)量,并在結(jié)果不確定時(shí)納入更多區(qū)域或數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
然后建議參照組織病理學(xué)特征或者IHC結(jié)果確定可能存在擴(kuò)增的浸潤(rùn)性乳腺癌/胃癌區(qū)域,選擇細(xì)胞核大小一致、胞核邊界完整、DAPI染色均一、細(xì)胞核無(wú)重疊、熒光信號(hào)清晰的細(xì)胞,隨機(jī)計(jì)數(shù)2個(gè)區(qū)域中的至少20個(gè)細(xì)胞,并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
(六)穩(wěn)定性研究資料
根據(jù)本產(chǎn)品特性,申請(qǐng)人應(yīng)分別從實(shí)時(shí)穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、開(kāi)瓶/凍融穩(wěn)定性,以及使用過(guò)程中的雜交后信號(hào)穩(wěn)定性、探針的光照穩(wěn)定性等方面對(duì)產(chǎn)品的穩(wěn)定性進(jìn)行研究,充分考慮在實(shí)際的運(yùn)輸、保存和使用條件下對(duì)產(chǎn)品性能的影響。其中使用過(guò)程穩(wěn)定性應(yīng)評(píng)價(jià)在實(shí)際使用的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件下,不同的光照條件對(duì)熒光標(biāo)記探針以及雜交后樣本熒光信號(hào)強(qiáng)度的影響,注意應(yīng)覆蓋檢測(cè)的全過(guò)程。評(píng)價(jià)指標(biāo)應(yīng)至少包括靈敏度、特異性以及熒光信號(hào)強(qiáng)度。
樣本中核酸的完整性對(duì)于結(jié)果的正確判讀也十分關(guān)鍵。申請(qǐng)人應(yīng)充分考慮臨床樣本采集、處理、運(yùn)輸、儲(chǔ)存與切片制備等各個(gè)階段的條件,如溫度、濕度對(duì)樣本質(zhì)量的影響,全面評(píng)價(jià)臨床樣本、質(zhì)控品和企業(yè)參考品的穩(wěn)定性。樣本穩(wěn)定性應(yīng)分別評(píng)價(jià)石蠟包埋組織塊與組織切片的穩(wěn)定性,評(píng)價(jià)指標(biāo)應(yīng)至少包括儲(chǔ)存溫度及時(shí)間。
(七)臨床評(píng)價(jià)資料
臨床試驗(yàn)總體要求及臨床試驗(yàn)資料的內(nèi)容應(yīng)符合《辦法》、2014年第44號(hào)公告和《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的規(guī)定,以下僅結(jié)合人表皮生長(zhǎng)因子受體2基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒(熒光原位雜交法)的具體特點(diǎn)對(duì)其臨床試驗(yàn)中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注的內(nèi)容進(jìn)行闡述。
1.臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)及人員的要求
申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)選定不少于3家(含3家)已備案的醫(yī)療器械臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu),按照有關(guān)規(guī)定開(kāi)展臨床試驗(yàn)。申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)及其預(yù)期用途,綜合不同地區(qū)人種、流行病學(xué)背景等因素選擇臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)。臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)必須具有與申報(bào)試劑相適應(yīng)的專業(yè)技術(shù)人員及儀器設(shè)備,并能夠確保該項(xiàng)試驗(yàn)的實(shí)施。
2.試驗(yàn)方案
2.1各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致,且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過(guò)程中遵循預(yù)定的方案實(shí)施,不可隨意改動(dòng)。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程應(yīng)在臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成,需強(qiáng)調(diào)組織標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)采樣、及時(shí)在10%中性緩沖福爾馬林溶液中充分固定及其他標(biāo)準(zhǔn)操作程序。申報(bào)單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外,不得隨意干涉試驗(yàn)進(jìn)程,尤其是數(shù)據(jù)收集過(guò)程。
2.2以圖表的形式對(duì)試驗(yàn)總體設(shè)計(jì)及工作流程進(jìn)行描述,圖表中應(yīng)包括連續(xù)切片的數(shù)量及用途分配等。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)選用的對(duì)比試劑應(yīng)保持一致,以便進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
2.3試驗(yàn)方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的病例納入/排除選擇標(biāo)準(zhǔn),任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床試驗(yàn)都應(yīng)記錄在案,并明確說(shuō)明原因。
2.4試驗(yàn)方案中應(yīng)明確閱片者、操作者的選擇標(biāo)準(zhǔn)。閱片者應(yīng)選擇在免疫組織化學(xué)、熒光原位雜交技術(shù)應(yīng)用和乳腺癌/胃癌病理診斷中有豐富經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)學(xué)工作者。
2.5在試驗(yàn)操作過(guò)程中和判定檢測(cè)結(jié)果時(shí)應(yīng)采用盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。臨床試驗(yàn)研究方案中應(yīng)詳述盲法的具體操作流程。
2.6臨床試驗(yàn)前申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)參與人員進(jìn)行相關(guān)技術(shù)培訓(xùn),并采用統(tǒng)一判讀標(biāo)準(zhǔn),保持各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的判讀一致性。注意判讀方法與說(shuō)明書(shū)要求一致。
2.7在整個(gè)試驗(yàn)中,試驗(yàn)用體外診斷試劑和對(duì)比試劑都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下,最大限度保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。臨床試驗(yàn)研究方案中應(yīng)明確質(zhì)控方法及配合用質(zhì)控試劑的詳細(xì)信息。
3.試驗(yàn)方法
3.1“已有同品種批準(zhǔn)上市”產(chǎn)品
應(yīng)選擇已批準(zhǔn)上市,且已經(jīng)充分聯(lián)合藥物進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)的伴隨診斷試劑作為對(duì)比試劑,證明本品與已上市產(chǎn)品等效。
3.2新產(chǎn)品
用于胃癌等其他用途的此類檢測(cè)試劑,如無(wú)已上市同類產(chǎn)品,應(yīng)選擇臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)已建立的參考方法(應(yīng)可報(bào)告腫瘤細(xì)胞HER2基因平均拷貝數(shù)和腫瘤細(xì)胞CEP17平均拷貝數(shù))為參比方法,進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的一致性研究。該參考方法應(yīng)已經(jīng)充分聯(lián)合藥物進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)。
3.3對(duì)于預(yù)期用途中已明確配合具體治療藥物名稱的檢測(cè)試劑,應(yīng)采用聯(lián)合藥物評(píng)價(jià)臨床試驗(yàn)的形式,同時(shí)評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果與接受靶向治療藥物后療效的相關(guān)性和試驗(yàn)用體外診斷試劑檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
3.4臨床試驗(yàn)用樣本的選擇和樣本量
臨床試驗(yàn)應(yīng)選擇經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定的石蠟包埋組織樣本或組織芯片。
應(yīng)根據(jù)設(shè)定的符合率接受標(biāo)準(zhǔn)和選定的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分別計(jì)算總樣本例數(shù)及IHC檢測(cè)結(jié)果為HER2(2+)的樣本例數(shù)。但總樣本例數(shù)不低于1000例。其中IHC檢測(cè)結(jié)果為HER2(2+)的樣本不少于400例。如申報(bào)試劑聲稱可以用于檢測(cè)兩種或兩種以上腫瘤類型,則應(yīng)在一種類型滿足上述要求的基礎(chǔ)上,對(duì)每種新增的腫瘤類型進(jìn)行不少于300例樣本的臨床驗(yàn)證,IHC檢測(cè)結(jié)果為HER2(2+)的樣本不少于120例。樣本的選擇應(yīng)包含臨床預(yù)期使用人群和特異性樣本,注意包含臨床相關(guān)的各種病理組織類型。
對(duì)于適應(yīng)癥為浸潤(rùn)性乳腺癌的情況,樣本應(yīng)包含臨床常見(jiàn)的各種浸潤(rùn)性乳腺癌病理組織類型,如乳腺浸潤(rùn)性癌非特殊類型、乳腺浸潤(rùn)性小葉癌、小管癌、粘液癌。特異性樣本應(yīng)包含腺病及纖維腺瘤。
對(duì)于適應(yīng)癥為胃癌的情況,樣本應(yīng)包含臨床常見(jiàn)的各種腺癌病理組織類型,如腸型、彌漫型、混合型(Lauren分型)。特異性樣本應(yīng)包含胃粘膜慢性炎。
4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
4.1對(duì)臨床試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法。
4.1.1對(duì)于本類試劑,常以配對(duì)列聯(lián)表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測(cè)結(jié)果,分別計(jì)算全部樣本的陽(yáng)性符合率、陰性符合率和總符合率以及IHC檢測(cè)結(jié)果為HER2(2+)樣本的陽(yáng)性符合率、陰性符合率和總符合率。應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)或推斷方法(如95%置信區(qū)間),給出不確定樣本占全部樣本的比例,并評(píng)價(jià)其對(duì)符合率的影響,以檢驗(yàn)兩種試劑檢測(cè)結(jié)果的一致性。
4.1.2由于此類試劑在臨床結(jié)果的報(bào)告中同時(shí)報(bào)告腫瘤細(xì)胞HER2基因平均拷貝數(shù)、腫瘤細(xì)胞CEP17平均拷貝數(shù)(雙探針適用)和兩者的比值(雙探針適用),因此還應(yīng)對(duì)拷貝數(shù)的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)價(jià)??刹捎迷囼?yàn)用體外診斷試劑(考核試劑)與對(duì)比試劑或參考方法檢測(cè)結(jié)果的腫瘤細(xì)胞HER2基因平均拷貝數(shù)和腫瘤細(xì)胞CEP17平均拷貝數(shù)(雙探針適用)做散點(diǎn)圖的方法,配合適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)分析方法,如以線性回歸為基礎(chǔ)的分析方法或Bland-Altman方法等,評(píng)價(jià)考核試劑與對(duì)比試劑對(duì)于腫瘤細(xì)胞HER2基因平均拷貝數(shù)和腫瘤細(xì)胞CEP17平均拷貝數(shù)(雙探針適用)檢測(cè)結(jié)果的一致性。
4.2對(duì)臨床試驗(yàn)中人群基本特征進(jìn)行分析,包括:年齡、性別、病理組織類型、癌癥分期情況、免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果等(見(jiàn)表1)。
4.3聯(lián)合藥物評(píng)價(jià)臨床試驗(yàn)部分
可采用前瞻性或回顧性研究方法,結(jié)合接受藥物治療后的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)等,分析檢測(cè)結(jié)果。此部分研究通常使用Kaplan Meier曲線等生存數(shù)據(jù)分析方法,選取適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)方法檢驗(yàn)客觀有效率,評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果與用藥后臨床結(jié)局之間的相關(guān)性。樣本數(shù)量應(yīng)符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。
5.結(jié)果差異樣本的驗(yàn)證
在數(shù)據(jù)收集過(guò)程中,對(duì)兩種試劑檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本,應(yīng)采用第三方試劑或其他合理的方法進(jìn)行復(fù)核,同時(shí)結(jié)合組織病理學(xué)特征、免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果等對(duì)差異產(chǎn)生原因進(jìn)行分析。
6.質(zhì)量控制
由于檢測(cè)前預(yù)處理步驟較多,導(dǎo)致判讀結(jié)果可能會(huì)在試驗(yàn)人員間、實(shí)驗(yàn)室間產(chǎn)生差異。為了客觀單一評(píng)價(jià)試劑性能,盡量減少這種人為差異對(duì)最終結(jié)果造成的影響,臨床試驗(yàn)開(kāi)始前,各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)統(tǒng)一操作方法,進(jìn)行判讀一致性訓(xùn)練及統(tǒng)一的質(zhì)量控制,確保同樣的樣本在不同機(jī)構(gòu)之間的判讀結(jié)果保持一致。注意應(yīng)包含IHC以及FISH檢測(cè)結(jié)果為陰性、陽(yáng)性和不確定的樣本。該預(yù)評(píng)估內(nèi)容、實(shí)現(xiàn)方法、結(jié)果等應(yīng)在臨床試驗(yàn)報(bào)告中體現(xiàn)。
7.原始數(shù)據(jù)
7.1提交病例報(bào)告表(Case Report Form,CRF),內(nèi)容應(yīng)至少包括:性別、年齡、標(biāo)本的采集部位、標(biāo)本類型、病理診斷結(jié)果(包含分級(jí))、HE染色結(jié)果、免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果、考核試劑檢測(cè)結(jié)果、對(duì)比試劑檢測(cè)結(jié)果、第三方復(fù)核結(jié)果。所有采用原位雜交法的檢測(cè)結(jié)果均應(yīng)包含評(píng)估的細(xì)胞數(shù)量、HER2基因/CEP17熒光信號(hào)比值(雙探針適用)、每個(gè)細(xì)胞的平均HER2拷貝數(shù)、每個(gè)細(xì)胞的平均CEP17拷貝數(shù)(雙探針適用)和定性判讀結(jié)果。
7.2提交入選樣本結(jié)果的代表性彩色圖片。
8.臨床試驗(yàn)總結(jié)報(bào)告撰寫(xiě)
根據(jù)《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求,臨床試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)對(duì)試驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述,應(yīng)對(duì)整個(gè)臨床試驗(yàn)實(shí)施過(guò)程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述,并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析方法。建議在臨床試驗(yàn)總結(jié)報(bào)告中對(duì)以下內(nèi)容進(jìn)行詳述:
8.1臨床試驗(yàn)總體設(shè)計(jì)及方案描述
8.1.1臨床試驗(yàn)的整體管理情況、臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)選擇、臨床主要試驗(yàn)人員的選擇、人員簡(jiǎn)介等基本情況介紹;
8.1.2病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)、標(biāo)本的選擇例數(shù)及標(biāo)準(zhǔn);
8.1.3樣本類型,樣本的收集、處理及保存等;
8.1.4陰、陽(yáng)性判讀標(biāo)準(zhǔn)、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法、統(tǒng)計(jì)軟件、評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)及樣本量確定依據(jù)。
8.2臨床試驗(yàn)具體情況
8.2.1試驗(yàn)用體外診斷試劑和對(duì)比試劑的名稱、批號(hào)、有效期等信息;
8.2.2對(duì)各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的病例數(shù)、人群分布情況進(jìn)行總合,建議以列表或圖示方式給出具體例數(shù)及百分比;
8.2.3質(zhì)量控制,試驗(yàn)人員培訓(xùn)、質(zhì)控片的檢測(cè)情況,對(duì)檢測(cè)結(jié)果判讀的抽查結(jié)果評(píng)估;
8.2.4具體試驗(yàn)過(guò)程,樣本檢測(cè)、數(shù)據(jù)收集、樣本保存、結(jié)果不一致樣本的驗(yàn)證等。
8.3臨床試驗(yàn)結(jié)果及分析
8.3.1數(shù)據(jù)預(yù)處理、差異結(jié)果的重新檢測(cè)或采用其他合理的方法進(jìn)行復(fù)核及無(wú)法評(píng)估樣本的處理、試驗(yàn)過(guò)程中是否涉及對(duì)方案的修改。
8.3.2結(jié)果的一致性分析
計(jì)算陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%(或99%)的置信區(qū)間。采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法,對(duì)定性結(jié)果的檢測(cè)一致性和拷貝數(shù)檢測(cè)一致性進(jìn)行評(píng)價(jià)。采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)聯(lián)合藥物臨床評(píng)價(jià)部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行分析評(píng)價(jià),研究檢測(cè)結(jié)果與用藥后臨床結(jié)局之間的相關(guān)性(如適用)。
8.4討論和結(jié)論
對(duì)整體結(jié)果進(jìn)行總結(jié)性描述并簡(jiǎn)要分析試驗(yàn)結(jié)果,對(duì)本次臨床試驗(yàn)的特別說(shuō)明(如有),最后得出臨床試驗(yàn)結(jié)論。
(八)產(chǎn)品技術(shù)要求
申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下,根據(jù)產(chǎn)品研制、臨床評(píng)價(jià)等結(jié)果,依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn),編寫(xiě)產(chǎn)品技術(shù)要求。需符合《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫(xiě)指導(dǎo)原則》(國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號(hào))的要求。
產(chǎn)品性能指標(biāo)主要包括:外觀、熒光信號(hào)強(qiáng)度、靈敏度、特異性、陽(yáng)性符合率、陰性符合率等。如果申報(bào)試劑已有適用的國(guó)家參考品/標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)布,則申請(qǐng)人應(yīng)在產(chǎn)品技術(shù)要求中提出檢測(cè)要求。另外,產(chǎn)品技術(shù)要求中應(yīng)以附錄形式明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求,需符合相關(guān)編寫(xiě)規(guī)范的要求。
(九)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、檢測(cè)方法及檢測(cè)結(jié)果解釋等重要信息,是指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對(duì)檢測(cè)結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù),是體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)最重要的文件之一。產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導(dǎo)原則》(國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號(hào))的要求。
結(jié)合《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導(dǎo)原則》的要求,以下詳細(xì)說(shuō)明書(shū)的重點(diǎn)內(nèi)容,以指導(dǎo)注冊(cè)申報(bào)人員更合理地完成說(shuō)明書(shū)編制。
1.【預(yù)期用途】
應(yīng)至少包括以下內(nèi)容:
1.1試劑盒用于體外定性檢測(cè)經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定石蠟包埋乳腺癌和/或胃癌組織切片中HER2基因的擴(kuò)增情況。用于指導(dǎo)乳腺原發(fā)性浸潤(rùn)癌和/或胃及胃食管結(jié)合部腺癌的藥物治療和/或預(yù)后評(píng)估(預(yù)后評(píng)估僅乳腺癌適用)。
1.2明確目標(biāo)人群:例如對(duì)所有乳腺原發(fā)性浸潤(rùn)癌原發(fā)灶、復(fù)發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶(如可以獲取到足夠的樣本)所有經(jīng)病理診斷證實(shí)為胃及胃食管結(jié)合部腺癌,新輔助治療后病灶及復(fù)發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶(如可以獲取到足夠的樣本)進(jìn)行檢測(cè)。因腫瘤個(gè)體化診療研究和發(fā)展不斷深入,該目標(biāo)人群可能隨著個(gè)體化治療藥物和試劑的研究和發(fā)展而發(fā)生變化,建議申請(qǐng)人參照最新指南或?qū)<夜沧R(shí)設(shè)定申報(bào)產(chǎn)品的目標(biāo)人群。
1.3簡(jiǎn)單介紹HER2基因的生物學(xué)特征,如基本結(jié)構(gòu)、編碼蛋白及與腫瘤預(yù)后判斷、用藥指導(dǎo)的關(guān)系。
1.4簡(jiǎn)單介紹與IHC檢測(cè)之間的關(guān)系。建議說(shuō)明臨床應(yīng)用過(guò)程中首先考慮使用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)HER2蛋白的過(guò)表達(dá)狀態(tài),在結(jié)果為(2+)的情況下需進(jìn)一步應(yīng)用原位雜交方法確定HER2基因的擴(kuò)增狀態(tài)。
1.5如未進(jìn)行聯(lián)合藥物評(píng)價(jià)臨床試驗(yàn),則不應(yīng)體現(xiàn)具體藥物產(chǎn)品(商品)名稱、生產(chǎn)企業(yè)信息等,并注明該產(chǎn)品未與具體藥物聯(lián)合進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)。
1.6明確說(shuō)明該試劑盒僅用于對(duì)特定腫瘤患者HER2基因擴(kuò)增情況的檢測(cè),其檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考,不應(yīng)作為患者個(gè)體化治療的唯一依據(jù),臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情、藥物適應(yīng)癥、治療反應(yīng)及其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)等因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。
2.【檢測(cè)原理】
簡(jiǎn)述熒光原位雜交技術(shù)的基本原理。對(duì)特異性結(jié)合靶基因,探針長(zhǎng)度、序列設(shè)計(jì)、標(biāo)記染料名稱及標(biāo)記方法,預(yù)處理、雜交與復(fù)染過(guò)程,熒光信號(hào)觀察、計(jì)數(shù)和比值計(jì)算的方法等內(nèi)容進(jìn)行介紹。
3.【主要組成成分】
3.1說(shuō)明試劑盒包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息;質(zhì)控片(如有)的組織或細(xì)胞株名稱。
3.2對(duì)檢測(cè)中使用的探針信息進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹。
3.3試劑盒中不包含但對(duì)該項(xiàng)檢測(cè)必需的組分,應(yīng)列出相關(guān)試劑、質(zhì)控片(如適用)的名稱與貨號(hào);耗材的規(guī)格(材質(zhì))要求;化學(xué)制劑的純度和濃度(如適用)要求及其他相關(guān)信息。
4.【儲(chǔ)存條件及有效期】
對(duì)試劑的儲(chǔ)存條件、有效期、開(kāi)封穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性和凍融次數(shù)限制等信息做詳細(xì)介紹。如試劑盒包含質(zhì)控片還應(yīng)在此處明確質(zhì)控片的穩(wěn)定性。
5.【適用儀器】
明確配套適用熒光顯微鏡的配置要求,至少包括對(duì)目鏡與物鏡的放大倍率、光源及濾光片要求。對(duì)顯微鏡配套耗材(如鏡油)的要求進(jìn)行介紹。
6.【樣本要求】
重點(diǎn)明確以下內(nèi)容:
6.1對(duì)適用樣本的取材、固定、包埋與切片的具體要求。此部分內(nèi)容可參考國(guó)際或國(guó)內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)操作性文件內(nèi)容進(jìn)行編寫(xiě)或引用。注意不同組織類型的樣本應(yīng)分別描述。
6.2樣本的穩(wěn)定性(包括蠟塊與切片)。
7.【檢測(cè)方法】
詳細(xì)說(shuō)明操作的各個(gè)步驟:
7.1明確檢測(cè)需要的儀器與設(shè)備。如烤片機(jī)、恒溫箱、水浴鍋、染色缸、雜交盒等。注明貨號(hào)及生產(chǎn)商(如需要)。
7.2試劑配制方法、注意事項(xiàng),試劑開(kāi)封、配制后使用方法及注意事項(xiàng)等。
7.3對(duì)于手工或半自動(dòng)檢測(cè),詳述脫蠟、煮片、消化、固定、核酸變性、雜交、洗滌和復(fù)染等各操作步驟。描述應(yīng)盡量細(xì)化,需明確各步驟處理時(shí)間、溫度、注意事項(xiàng)(如避光)等內(nèi)容。
7.4對(duì)雜交后載玻片的儲(chǔ)存及穩(wěn)定性、復(fù)染后的儲(chǔ)存及穩(wěn)定性進(jìn)行說(shuō)明。
7.5詳細(xì)說(shuō)明質(zhì)量控制情況:
建議實(shí)驗(yàn)室每次檢測(cè)設(shè)置內(nèi)對(duì)照和外對(duì)照(質(zhì)控片),以對(duì)整體操作流程進(jìn)行質(zhì)量控制。評(píng)價(jià)指標(biāo)應(yīng)包括細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性,探針雜交信號(hào)的強(qiáng)度和位點(diǎn)的準(zhǔn)確性,背景熒光強(qiáng)度,可計(jì)數(shù)信號(hào)(單色/雙色)的細(xì)胞占全部細(xì)胞的比例等。
7.5.1內(nèi)對(duì)照可為癌旁正常組織,明確樣本檢測(cè)的內(nèi)對(duì)照使用原則,如“75%以上的腫瘤細(xì)胞核中都有雜交信號(hào)時(shí),視為檢測(cè)成功?!?/p>
7.5.2外對(duì)照可選擇已知HER2基因擴(kuò)增狀態(tài)的組織切片或者細(xì)胞株,至少包括臨界值以及無(wú)擴(kuò)增樣本。明確每一批次患者樣本檢測(cè)和更換使用新的試劑盒批次時(shí),均應(yīng)同時(shí)進(jìn)行質(zhì)控片檢測(cè),以監(jiān)控檢測(cè)性能并評(píng)估信號(hào)計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。分析質(zhì)控結(jié)果不符合要求的原因并詳述處理方式。
如試劑盒內(nèi)不包含質(zhì)控片,應(yīng)明確配套使用的質(zhì)控片信息,可以為商用質(zhì)控片也可以為臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室自制質(zhì)控片。自制質(zhì)控片應(yīng)為已知FISH結(jié)果的陰性和陽(yáng)性質(zhì)控片,詳述質(zhì)控片的制備方法。明確質(zhì)控結(jié)果要求(試驗(yàn)有效性的判斷),結(jié)果允許范圍(如適用于不同的儀器或適用于手工與儀器方法,應(yīng)分別列明結(jié)果的允許范圍)。
7.6建議強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)相關(guān)的儀器設(shè)備需定期維護(hù)、校驗(yàn),應(yīng)建立完善的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范文件,從事檢測(cè)的技術(shù)人員和病理醫(yī)師應(yīng)通過(guò)必要的培訓(xùn)和資格考核,做好記錄和存檔,內(nèi)部定期對(duì)不同批次檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行重復(fù)性分析;并積極參加相關(guān)的外部質(zhì)控活動(dòng)。
8.【陽(yáng)性判斷值】
根據(jù)相關(guān)指南及規(guī)范性文件,以HER2拷貝數(shù)平均值/細(xì)胞和/或HER2總拷貝數(shù)與CEP17總拷貝數(shù)的比值(雙信號(hào))的形式明確陽(yáng)性判斷值。
9.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】
9.1從細(xì)胞核形態(tài)、探針信號(hào)強(qiáng)度、背景情況等多方面,詳述雜交后樣本玻片的有效性評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。建議對(duì)不符合有效性評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)情況發(fā)生時(shí)的常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法以列表的形式明確。
9.2明確目標(biāo)區(qū)域的確定方法及僅對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)的要求;明確細(xì)胞計(jì)數(shù)的具體方法,包括每個(gè)樣本初始讀取細(xì)胞數(shù)及結(jié)果不確定樣本的處理方法。明確HER2擴(kuò)增異質(zhì)性的處理方法。
可以列表的形式詳述信號(hào)計(jì)數(shù)與陰陽(yáng)性判定規(guī)則,應(yīng)配合清晰彩圖圖例。例如對(duì)于浸潤(rùn)性乳腺癌,描述為“找到至少2個(gè)浸潤(rùn)癌區(qū)域,隨機(jī)計(jì)數(shù)至少20個(gè)浸潤(rùn)癌細(xì)胞核中的雙色信號(hào),計(jì)算信號(hào)比值(比值=計(jì)數(shù)細(xì)胞核中紅色信號(hào)總數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞核中綠色信號(hào)總數(shù)),根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣本進(jìn)行HER2基因擴(kuò)增陰陽(yáng)性的判斷:比值≥2.0,或者比值<2.0且平均HER2拷貝數(shù)/CEP17拷貝數(shù)≥6.0時(shí)為陽(yáng)性;擴(kuò)增細(xì)胞應(yīng)均質(zhì)、連續(xù),且占浸潤(rùn)癌的10%以上。比值<2.0且平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞<4.0時(shí)為陰性。HER2/CEPl7比值<2.0且平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞<6.0,但≥4.0時(shí)為不確定。對(duì)于不確定的樣本,需再計(jì)算20個(gè)細(xì)胞核中的信號(hào),或由另一閱片人重新計(jì)數(shù)。”
10.【檢驗(yàn)方法的局限性】
綜合產(chǎn)品的預(yù)期用途、臨床背景、檢測(cè)方法及適用范圍等信息,對(duì)可能出現(xiàn)的局限性進(jìn)行相關(guān)說(shuō)明,主要包括以下描述,請(qǐng)申請(qǐng)人選擇適用的條款在產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中予以闡述。
10.1本試劑盒為體外診斷試劑,檢測(cè)結(jié)果的臨床判定均應(yīng)結(jié)合患者醫(yī)療病史和其他臨床診斷結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)估,不得作為臨床診治的唯一依據(jù)。
10.2腫瘤組織HER2基因表達(dá)的異質(zhì)性可能影響檢測(cè)結(jié)果。例如可導(dǎo)致IHC與ISH檢測(cè)、原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶、活檢標(biāo)本與手術(shù)切除標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果不一致。異質(zhì)性在胃癌中更常見(jiàn)。對(duì)于胃鏡活檢標(biāo)本,多點(diǎn)活檢有助于減少腫瘤異質(zhì)性的影響,提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。另外,新輔助治療會(huì)影響胃癌HER2狀態(tài),治療前活檢標(biāo)本和治療后手術(shù)標(biāo)本的綜合判斷有助于更好的用藥指導(dǎo)。
10.3本試劑盒檢測(cè)結(jié)果受樣本來(lái)源、樣本采集過(guò)程、樣本質(zhì)量、樣本運(yùn)輸條件、樣本預(yù)處理等因素影響。同時(shí)由于結(jié)果判斷的主觀性,可能導(dǎo)致得出假陽(yáng)性或假陰性的檢測(cè)結(jié)果,使用者應(yīng)了解檢測(cè)過(guò)程中可能存在的潛在錯(cuò)誤導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確等局限性。
10.4檢測(cè)結(jié)果如與組織病理學(xué)特征不符,應(yīng)核實(shí)病理診斷或重新檢測(cè)。
10.5本產(chǎn)品的性能指標(biāo)是基于說(shuō)明書(shū)所述檢測(cè)程序獲得,對(duì)該程序進(jìn)行更改,可能會(huì)改變?cè)摍z驗(yàn)的結(jié)果。
10.6本試劑僅對(duì)經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定石蠟包埋的組織進(jìn)行了驗(yàn)證(如適用),不得用于其他樣本類型或流式細(xì)胞檢測(cè)等其他用途。
11.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】
根據(jù)分析性能評(píng)估研究結(jié)果,詳述以下性能指標(biāo),包括研究方法和評(píng)估結(jié)果:
11.1靈敏度:在乳腺浸潤(rùn)癌/胃癌病例的組織樣本,以及癌旁正常組織或者良性疾病組織樣本中探針與目標(biāo)基因位點(diǎn)的結(jié)合效率。
11.2特異性:HER2和CEP17探針對(duì)目標(biāo)序列識(shí)別的特異性。
11.3陰、陽(yáng)性符合率:在不同組織類型中HER2基因的檢出能力和準(zhǔn)確性。
11.4精密度:批內(nèi)、批間精密度及不同時(shí)間、地點(diǎn)、檢測(cè)系統(tǒng)(如適用)、人員之間的精密度。
11.5臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)總結(jié)。
12.【注意事項(xiàng)】
12.1有關(guān)試劑盒內(nèi)人源組分(如有)生物安全性的警告。
12.2有關(guān)實(shí)驗(yàn)操作中涉及試劑的安全性提示,包括對(duì)有毒有害物質(zhì)的防護(hù)及危險(xiǎn)物品的處理方法等。
12.3熒光染料在光照條件下容易淬滅。為降低該影響,對(duì)所有含熒光探針的溶液,包括雜交后樣本載玻片均應(yīng)盡量避免或者減少在光照條件下保存和處理。
12.4使用校準(zhǔn)過(guò)的溫度計(jì)測(cè)定溶液、水浴槽和溫箱溫度。
三、編寫(xiě)單位
國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心。
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