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病原體特異性M型免疫球蛋白定性檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則
（2013年第3號）

一、前言

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對病原體特異性M型免疫球蛋白（Immunoglobulin M，IgM）定性檢測試劑注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門對注冊申報資料的技術(shù)審評提供參考。

本指導(dǎo)原則是對病原體特異性IgM抗體定性檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進(jìn)行充實和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是對申請人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細(xì)的研究資料和驗證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時進(jìn)行調(diào)整。

二、適用范圍

病原體特異性IgM抗體定性檢測試劑是指利用酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光法或磁微粒酶免疫技術(shù)等基于抗原抗體反應(yīng)原理，以特定病原體的特異性IgM抗體為檢測目標(biāo)，對人血清或血漿樣本中病原體特異性IgM抗體進(jìn)行體外定性檢測的試劑。本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行首次注冊申報和相關(guān)許可事項變更的產(chǎn)品。

根據(jù)結(jié)構(gòu)不同，人免疫球蛋白可分為G型免疫球蛋白（IgG）、M型免疫球蛋白（IgM）、A型免疫球蛋白（IgA）、E型免疫球蛋白（IgE）和D型免疫球蛋白（IgD）5種類型， IgM占血清免疫球蛋白總量的5%～10%。分泌型IgM為五聚體，是分子量最大的免疫球蛋白分子，一般不能通過血管壁，主要存在于血液中。五聚體IgM含10個抗原結(jié)合片段（Fab段），有很強(qiáng)的抗原結(jié)合能力，含5個可結(jié)晶化片段（Fc段），比G型免疫球蛋白（IgG）更易激活補(bǔ)體，IgM抗體一般為保護(hù)性抗體，具有免疫性。IgM是個體發(fā)育過程中最早合成和分泌的抗體，在胚胎發(fā)育晚期的胎兒即能產(chǎn)生IgM，且由于IgM分子量大，不能通過母血進(jìn)入胎兒體內(nèi)，故臍帶血或新生兒血液中特異性IgM升高常提示胎兒或新生兒存在宮內(nèi)或圍生期感染。在病原體感染的初次體液免疫應(yīng)答中（原發(fā)性感染），特異性IgM抗體首先出現(xiàn)，但其普遍反應(yīng)短暫，一般幾周后即不易再測到。病原體特異性IgM抗體陽性常提示早期感染，可用于感染急性期的輔助判斷。人血液樣本中病原體特異性IgM抗體的定性檢測，對某些傳染病如甲型肝炎、乙型肝炎、TORCH（弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒及單純皰疹病毒）類病原體感染等有較高的臨床參考價值。不具備病原體分離培養(yǎng)鑒定實驗室的臨床檢測機(jī)構(gòu)常將病原體特異性IgM抗體的檢測作為早期感染的唯一依據(jù)，因此，病原體特異性IgM抗體檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性顯得頗為重要。假陽性結(jié)果可能導(dǎo)致病人接受不必要的抗病原體治療而假陰性結(jié)果則有可能造成患者治療的延誤，由特異性IgM抗體檢測造成的誤診或漏診對孕婦或胎兒可能造成很大傷害。相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)必須充分意識到該類產(chǎn)品的潛在風(fēng)險，根據(jù)本指導(dǎo)原則的要求對該類試劑的安全性和有效性進(jìn)行科學(xué)合理的驗證。

三、基本要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品臨床適用癥背景情況、預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、研究結(jié)果的總結(jié)評價以及同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容，其中同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從方法學(xué)及臨床適用范圍等方面寫明擬申報產(chǎn)品與目前市場上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。綜述資料注冊申報資料的重要組分之一，其內(nèi)容應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》（國食藥監(jiān)械〔2007〕229號）和《體外診斷試劑注冊申報資料基本要求》（國食藥監(jiān)械〔2007〕609號）的相關(guān)要求。另外，建議申請人對以下幾方面內(nèi)容進(jìn)行著重介紹：

1.特定病原體的生物學(xué)特性、結(jié)構(gòu)與功能、感染過程、潛伏期、特異性IgM抗體產(chǎn)生及可持續(xù)存在時間、病理背景等。

2.特定病原體感染相關(guān)的疾病情況、流行病學(xué)以及易患（高危）人群的說明。

3.對申報試劑檢測結(jié)果可能帶來的風(fēng)險進(jìn)行合理評估，即由申報試劑的假陽性/假陰性結(jié)果導(dǎo)致的對患者臨床診治、孕婦或胎兒的不恰當(dāng)處理、疫苗接種、流行病學(xué)等方面的負(fù)面影響。

4.用于特定病原體特異性IgM抗體檢測方法的發(fā)展歷程摘要及各種檢測方法的優(yōu)缺點評價。

（二）產(chǎn)品說明書

說明書承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、標(biāo)本采集及處理、實驗方法、檢測結(jié)果解釋以及注意事項等重要信息，是指導(dǎo)實驗室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對檢驗結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)，因此，產(chǎn)品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》（國食藥監(jiān)械〔2007〕240號）的要求，境外試劑的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說明書的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請人提交的注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨注明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。

結(jié)合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》（國食藥監(jiān)械〔2007〕240號）的要求，下面對病原體特異性IgM抗體定性檢測試劑說明書的重點內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說明，以指導(dǎo)注冊申報人員更合理地完成說明書編制。

1.【預(yù)期用途】 應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：

（1）試劑盒用于體外定性檢測人血清和/或血漿樣本中xx的特異性IgM抗體。

（2）簡單介紹待測目標(biāo)的特征，如特定病原體的生物學(xué)性狀、潛伏期、易感人群、感染后的臨床表現(xiàn)等臨床背景相關(guān)的信息介紹;適用于對哪些患者人群的檢測，如具有何種癥狀/體征的患者、相關(guān)的密切接觸者、地域要求或年齡限制（如有）等。

（3）病原體特異性IgM抗體的產(chǎn)生、持續(xù)時間、與特異性IgG、病原體核酸等其他檢測指標(biāo)的關(guān)聯(lián);

（4）該試劑盒的應(yīng)用是否需要配套使用的專用儀器，與靶抗體檢測相關(guān)的其他檢測技術(shù)的介紹。

2.【主要組成成分】

（1）說明試劑盒包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，陰性/陽性對照品可能含有人源組分，應(yīng)提供其生物學(xué)來源、滅活方法及無傳染性確認(rèn)的方法等。

（2）對檢測中使用的抗原及抗體的信息進(jìn)行簡單介紹。

（3）試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，企業(yè)應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱、貨號及其他相關(guān)信息。

3.【儲存條件及有效期】

對試劑盒的效期穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性等信息做詳細(xì)介紹。

膠體金試紙條產(chǎn)品應(yīng)對開封后未使用產(chǎn)品允許暴露于空氣中的溫度、濕度及期限等條件予以明確。

4.【樣本要求】 重點明確以下內(nèi)容：

（1）樣本采集前對患者的要求：如采集時間、采集順序等，是否受臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。

（2）樣本采集：說明采集方法及樣本類型，如有血漿樣本，應(yīng)注明對抗凝劑的要求。

（3）樣本處理及保存：樣本處理方法、保存條件及期限（短期、長期）、運輸條件等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否須恢復(fù)室溫，凍融次數(shù)。經(jīng)熱處理樣本是否可用、對儲存樣本的添加劑要求等。

（4）如果檢測系統(tǒng)含有某種IgG抗體的去除技術(shù)（IgG吸附劑），如抗人IgG抗體等，則應(yīng)包括IgG吸附劑使用相關(guān)的注意事項。例如：經(jīng)IgG吸附劑處理的樣本不能用于IgG類抗體的檢測;在檢測IgM類抗體的同時，檢測處理過的混合物中的IgG類抗體，以證實對IgG、類風(fēng)濕因子（RF）等去除的有效性等。

5.【檢驗方法】 詳細(xì)說明試驗操作的各個步驟：

（1）實驗環(huán)境：溫、濕度條件，檢測試劑及樣本的復(fù)溫要求及相關(guān)注意事項。例如：凍存樣本在復(fù)融后應(yīng)經(jīng)過充分的混勻再行檢測。

（2）試劑配制方法、注意事項，試劑開封后使用方法及注意事項等。

（3）試驗條件：操作步驟、溫度、時間、儀器波長等以及試驗過程中的注意事項。不同型號產(chǎn)品，加樣方法如有差異，建議分別以圖示方式描述清楚。

6.【檢驗結(jié)果的解釋】

結(jié)果判斷或計算：詳細(xì)描述對檢測結(jié)果的判定或計算方法、對質(zhì)控品（對照品）的檢測結(jié)果要求（試驗有效性的判斷）等。如果質(zhì)控品和病人樣本的使用方法不同，生產(chǎn)商應(yīng)注明必要的指導(dǎo)和解釋。建議在質(zhì)控品（對照品）結(jié)果解釋環(huán)節(jié)注明以下字樣：“如果質(zhì)控結(jié)果與預(yù)期不符，實驗室不應(yīng)出具檢測報告?！?/p>

7.【檢驗方法局限性】

綜合產(chǎn)品的預(yù)期用途、臨床背景、檢測方法及適用范圍等信息，對可能出現(xiàn)的局限性進(jìn)行相關(guān)說明，主要包括以下描述，請申請人選擇適用的條款在產(chǎn)品說明書中予以闡述。

（1）本產(chǎn)品檢測結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為臨床診治的唯一依據(jù)，對患者的臨床管理應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實驗室檢查（尤其是病原學(xué)檢測）、治療反應(yīng)及流行病學(xué)等信息綜合考慮。

（2）感染初期，病原體特異性IgM抗體未產(chǎn)生或滴度很低會導(dǎo)致陰性結(jié)果，如懷疑有病原體感染，應(yīng)提示患者在7-14天內(nèi)復(fù)查，抽取第二份樣本，并和第一份樣本在同條件下同時檢測，以確定是否有初次感染的血清轉(zhuǎn)化或病原體特異IgM或IgG抗體滴度明顯升高。

（3）高滴度病原體特異性IgG抗體會與特異性IgM抗體競爭抗原結(jié)合部位，會使檢測的敏感性降低，IgM結(jié)果可能會出現(xiàn)假性低值或陰性結(jié)果。尤其是懷疑先天性病原體感染的新生兒樣本，他們的血清中可能含有母親來源的高水平病原體特異的IgG抗體和胎兒產(chǎn)生的相對低水平的病原體特異IgM抗體，因此，對于該類樣本的陰性結(jié)果應(yīng)慎重分析。

（4）由于臍帶血中可能含有源于母體的病原體特異性IgM抗體（胎盤滲漏），因此，最好在出生后5天內(nèi)再對嬰兒的后續(xù)樣本進(jìn)行檢測，以證實臍帶血樣本病原體特異性IgM抗體的陽性結(jié)果。建議將新生兒與母親的血清樣本平行進(jìn)行測試，如果是胎兒的先天性感染，其IgM抗體水平（以及IgG抗體水平）會持續(xù)存在或呈上升趨勢， 反之，如果抗體來源于母體，則在在平行實驗中嬰兒的抗體水平會逐漸下降或消失。

（5）由于孕婦的實驗室檢查不能可靠地鑒定胎兒患病的風(fēng)險，故不建議采用本試劑對無癥狀的母體感染進(jìn)行篩查，不得將本試劑的檢測結(jié)果單獨作為終止妊娠的依據(jù)。

（6）免疫功能受損或接受免疫抑制治療的患者，如人類免疫缺陷病毒（HIV）感染患者或器官移植后接受免疫抑制治療的患者，其血清學(xué)IgM抗體檢測的參考價值有限，可能會導(dǎo)致錯誤的醫(yī)學(xué)解釋。

（7）在近幾個月內(nèi)接受過輸血或其他血液制品治療的人群，對其陽性檢測結(jié)果的分析應(yīng)慎重。

（8）病原體特異性IgM抗體不僅出現(xiàn)于初次感染，當(dāng)二次感染和復(fù)發(fā)感染時也可能出現(xiàn)。

（9）當(dāng)疾病的流行程度降低時陽性預(yù)測值降低，對低危人群陽性結(jié)果的解釋應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎。建議對申報試劑臨床研究中的病例人群特征進(jìn)行說明，并對適用人群的性別、年齡、地域等特征進(jìn)行明示。

8.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 詳述以下性能指標(biāo)：

（1）對相應(yīng)國家參考品（如有）檢測的符合情況。

（2）最低檢測限（分析靈敏度）：說明試劑的最低檢測濃度或滴度，簡單介紹最低檢測限的確定方法。

（3）企業(yè)內(nèi)部陽性/陰性參考品符合率，簡單介紹陽性參考品的來源、濃度梯度、陰性參考品組成、來源以及濃度梯度設(shè)置等信息。

（4）精密度：精密度參考品的組分、濃度及評價標(biāo)準(zhǔn)。

（5）分析特異性

①交叉反應(yīng)：對易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體的高水平IgM抗體、特異性IgG抗體等的驗證情況。

②干擾物質(zhì)：樣本中常見干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，如溶血、高脂、黃疸等干擾因子研究（結(jié)果應(yīng)量化表示，禁用輕度、嚴(yán)重等模糊表述），有關(guān)高濃度總IgM和IgG抗體、自身抗體、類風(fēng)濕因子（RF）、嗜異型性抗體等的干擾驗證。

③藥物影響：較常見的用于病原體感染治療的外用或內(nèi)服藥物對檢測結(jié)果的影響。

（6）鉤狀（HOOK）效應(yīng)：對高濃度特異性IgM抗體的鉤狀效應(yīng)驗證情況。

（7）對比試驗研究（如有）：簡要介紹參比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計學(xué)方法及統(tǒng)計分析結(jié)果。

9.【注意事項】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

（1）有關(guān)試劑盒內(nèi)人源組分（如有）生物安全性的警告。

（2）有關(guān)實驗操作、樣本保存及處理等其他注意事項。

（三）擬定產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)及編制說明

擬定產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合國食藥監(jiān)械〔2007〕229號和國食藥監(jiān)械〔2007〕609號文件的相關(guān)規(guī)定。另外，對于國產(chǎn)試劑，應(yīng)參考《中國生物制品規(guī)程》（2000年版），將擬申報產(chǎn)品的主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品檢定等內(nèi)容作為附錄附于標(biāo)準(zhǔn)正文后，并在正文的“產(chǎn)品分類”項中引出該附錄內(nèi)容。

病原體特異性IgM抗體檢測試劑的注冊檢測應(yīng)主要包括以下性能指標(biāo)：物理性狀、陽性參考品符合率、陰性參考品符合率、精密度、最低檢測限（分析靈敏度）等。陽性參考品主要考察對不同滴度情況下的檢測符合性。陰性參考品則是對分析特異性（交叉反應(yīng)）的驗證，應(yīng)主要包括易發(fā)生交叉反應(yīng)的其他病原體特異性IgM抗體的假陽性情況的考核。

如果擬申報試劑已有相應(yīng)的國家/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布，則企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求不得低于上述標(biāo)準(zhǔn)要求。

（四）注冊檢測

根據(jù)國食藥監(jiān)械〔2007〕229號文件要求，首次申請注冊的第三類產(chǎn)品應(yīng)該在國家食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)可的、具有相應(yīng)承檢范圍的醫(yī)療器械檢測機(jī)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)三個生產(chǎn)批次樣品的注冊檢測。對于已經(jīng)有國家參考品的病原體特異性IgM抗體項目，在注冊檢測時應(yīng)采用相應(yīng)的國家參考品進(jìn)行，對于目前尚無國家參考品的項目，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)自行建立穩(wěn)定的質(zhì)控體系并提供相應(yīng)的內(nèi)部參考品。

（五）主要原材料研究資料

1.試劑盒所用病原體抗原的制備、篩選、純化以及鑒定等詳細(xì)試驗資料，主要包括以下兩方面：

（1）企業(yè)自制抗原

如為天然抗原，則應(yīng)對病原體毒株選擇、病原體培養(yǎng)、抗原提取及純化、鑒定等實驗過程予以詳述;如為重組抗原，則應(yīng)提交有關(guān)特定基因選擇、基因序列、基因克隆、抗原表達(dá)及抗原純化鑒定等詳細(xì)內(nèi)容，并對基因克隆的整個過程進(jìn)行詳述，如特定脫氧核糖核酸（DNA）分子的體外處理、重組連接、導(dǎo)入宿主細(xì)胞、宿主細(xì)胞繁殖以及重組子表達(dá)等實驗過程。

（2）企業(yè)外購抗原，則應(yīng)詳述抗原的名稱及生物學(xué)來源，外購方名稱，提交外購方出具的抗原性能指標(biāo)及檢驗證書，詳述申請人對該抗原技術(shù)指標(biāo)的要求以及申請人確定該抗原作為主要原材料的依據(jù)。供貨商應(yīng)相對固定，不得隨意更換。

2.試劑盒所用抗體（如抗IgM-μ鏈抗體）的制備、篩選、純化以及鑒定等詳細(xì)試驗資料，主要包括以下兩方面：

（1）企業(yè)自制抗體

如使用天然抗原作為免疫原則應(yīng)明確該天然抗原的來源;如使用重組抗原或其他人工合成抗原作為免疫原，應(yīng)提供相應(yīng)的核酸組分及重組抗原的序列信息。申請人對所選抗體的技術(shù)指標(biāo)要求（如外觀、純度、蛋白濃度、效價等），確定該抗體作為主要原材料的依據(jù)。

（2）企業(yè)外購抗體，應(yīng)詳述抗體的名稱及生物學(xué)來源，外購方名稱，提交外購方出具的抗體性能指標(biāo)及檢驗證書，詳述申請人對該抗抗體技術(shù)指標(biāo)的要求以及申請人確定該抗體作為主要原材料的依據(jù)。供貨商應(yīng)相對固定，不得隨意更換。

申請人應(yīng)對主要生物原料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)要求如外觀、純度、蛋白濃度、效價等進(jìn)行確認(rèn)，并對制備完成的抗原成品進(jìn)行質(zhì)量檢驗以確認(rèn)其符合標(biāo)準(zhǔn)要求，整個生產(chǎn)工藝穩(wěn)定可靠。

3.其他主要原輔料的選擇及驗證資料，如固相載體、硝酸纖維素膜、反應(yīng)緩沖液等，該類原輔料一般均為外購，應(yīng)詳述每一原輔料的外購方名稱，提交外購方出具的每一原輔料性能指標(biāo)及檢驗證書，詳述申請人對每一原輔料技術(shù)指標(biāo)的要求以及申請人確定該原輔料作為主要原輔料的依據(jù)。

4.企業(yè)內(nèi)部參考品的原料選擇、制備、定值、統(tǒng)計學(xué)分析及相關(guān)的實驗驗證資料。應(yīng)提供對參考品性質(zhì)確認(rèn)的其他方法或試劑（建議采用國內(nèi)已上市的、臨床上普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類試劑）的相關(guān)信息。

（六）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

1.主要生產(chǎn)工藝介紹，可用流程圖方式表示，并簡要說明主要生產(chǎn)工藝的確定依據(jù)。

2.產(chǎn)品基本反應(yīng)原理介紹。

3.包被工藝研究，申請人應(yīng)考慮如包被液量、濃度、時間等指標(biāo)對產(chǎn)品性能的影響，通過試驗確定上述指標(biāo)的最佳組合。

4.顯色（發(fā)光）系統(tǒng)、酶作用底物等的介紹。

5.實驗體系反應(yīng)條件確定：申請人應(yīng)考慮反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、洗滌次數(shù)等條件對產(chǎn)品性能的影響，通過試驗確定上述條件的最佳組合。

6. 酶催化底物（發(fā)光或變色）的最適條件研究。

7.體系中樣品加樣方式及加樣量確定：申請人應(yīng)考慮樣品加樣方式、加樣量對產(chǎn)品檢測結(jié)果的影響，通過實驗確定最佳的加樣方式及加樣量。如樣本需采取稀釋或其他必要的方法進(jìn)行處理后方可用于最終檢測，申請人還應(yīng)對可用于樣本稀釋的基質(zhì)或處理方法進(jìn)行研究，通過試驗確定最終選擇的用于樣本稀釋的基質(zhì)或處理方法。

（七）分析性能評估資料

企業(yè)應(yīng)提交原廠在產(chǎn)品研制或成品驗證階段對試劑盒進(jìn)行的所有性能驗證的研究資料，包括具體研究方法、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)、試驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細(xì)資料。對于病原體特異性IgM抗體檢測試劑，建議著重對以下分析性能進(jìn)行研究。

1.最低檢測限（分析靈敏度）

選取特定滴度的病原體特異性IgM抗體樣本，做系列倍比稀釋，將檢測結(jié)果的陽性率在90%～95%（n≥20）的最大稀釋倍數(shù)作為試劑盒的最低檢測限。

2.分析特異性

（1）交叉反應(yīng)

用于病原體特異性IgM抗體檢測試劑交叉反應(yīng)驗證主要考慮以下幾方面可能性：

①對抗原結(jié)構(gòu)相近或臨床癥狀相似的其他病原體高水平IgM抗體血清進(jìn)行交叉反應(yīng)研究，如乙型肝炎病毒核心抗體（HBc）IgM、甲型肝炎病毒（HAV）IgM、弓形蟲、風(fēng)疹病毒、單純皰疹病毒以及巨細(xì)胞病毒IgM抗體等。

②高濃度病原體特異性IgG抗體與特異性IgM抗體的交叉反應(yīng)驗證。

申請人應(yīng)提交所有用于交叉反應(yīng)驗證的病原體來源、濃度或滴度確認(rèn)等信息。建議申請人將有關(guān)交叉反應(yīng)驗證的信息以列表的方式在產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項中列出。

（2）干擾物質(zhì)

①內(nèi)源性干擾

對樣本中常見的內(nèi)源性干擾物質(zhì)進(jìn)行檢測，如溶血、高脂、黃疸、類風(fēng)濕因子（RF）、抗核抗體（ANA）、抗線粒體抗體（AMA）、高濃度非特異性IgG和IgM抗體（血清總IgG和IgM）等。方法為對病原體特異性IgM抗體陰性、弱陽性（臨界濃度）的臨床或模擬添加樣本分別進(jìn)行驗證，樣本量選擇應(yīng)體現(xiàn)一定的統(tǒng)計學(xué)意義，說明樣本的制備方法及干擾實驗的評價標(biāo)準(zhǔn)，確定可接受的干擾物質(zhì)極限濃度。

②抗凝劑的干擾

如果試劑盒適用樣本類型包括血漿樣本，應(yīng)采用各種適用抗凝劑抗凝的血漿樣本分別與血清樣本進(jìn)行對比實驗研究。方法為對不少于50例源自同一患者的病原體特異性IgM抗體陰性、弱陽性（略高于臨界值）的血清和血漿樣本（不同抗凝劑各50例）進(jìn)行檢測以驗證申報試劑對于血清和血漿樣本的檢測結(jié)果的一致性。

③目前，病原體特異性IgM抗體檢測試劑通常采用捕獲法（又稱雙夾心法）和間接法兩種原理。后者是將病原體抗原包被在固相載體上，加入含待測IgM抗體的樣本后，待抗原抗體結(jié)合后，再加入酶標(biāo)記的抗IgM抗體進(jìn)行反應(yīng)，孵育后洗去未結(jié)合的酶結(jié)合物再加入酶底物顯色以反應(yīng)“抗原-抗體-酶標(biāo)二抗”復(fù)合物的存在。該方法在檢測特異性IgM抗體時存在一定不足，由于血清中存在的IgM類類風(fēng)濕因子能與IgG抗體結(jié)合，然后結(jié)合到酶標(biāo)二抗上，易造成假陽性，高效價的病原體特異性IgG抗體也可與IgM抗體競爭抗原結(jié)合位點而導(dǎo)致假陰性。因此，采用間接法（固相包被病原體抗原）的試劑，需要在病原體特異性IgM檢測前采用一定的方法去除樣本中的IgG類抗體，例如，在樣本緩沖液中加入抗人IgG抗體，可以特異性地結(jié)合血清或血漿中的IgG并沉淀，如果樣本中存在類風(fēng)濕因子，也將被抗人IgG-IgG的復(fù)合物所吸附而去除干擾。

基于上述理論，使用間接法原理的試劑盒，在樣本處理環(huán)節(jié)應(yīng)該設(shè)置一定的IgG消除體系以降低實驗中假陽性或假陰性的可能性。如果反應(yīng)體系中使用了相關(guān)的IgG吸附技術(shù)（IgG吸附劑）來去除類風(fēng)濕因子、抗核抗體或病原體特異性IgG抗體的干擾，應(yīng)以mg/dL為單位注明IgG吸附劑對樣本中人IgG抗體的吸附能力，并進(jìn)行以下的實驗研究：對至少10份臨界值附近的病原體特異性IgM抗體弱陽性并含有多水平病原體特異性IgG抗體的樣本進(jìn)行檢測，比較去除總IgG前后的結(jié)果，驗證IgG吸附劑消除干擾的效果，以上實驗可以采用人工制備的樣本進(jìn)行。

④對至少10份含有病原體特異性IgM抗體的樣本進(jìn)行IgM破壞實驗研究，方法為采用特定的化學(xué)制劑（如2-巰基乙醇或二硫蘇糖醇）處理樣本后，重新進(jìn)行檢測，IgM檢測結(jié)果應(yīng)為陰性。

5.精密度

企業(yè)應(yīng)對每項精密度指標(biāo)的評價標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)的范圍等，針對本類產(chǎn)品的精密度評價主要包括以下要求。

（1）對可能影響檢測精密度的主要變量進(jìn)行驗證，除申報試劑本身外，還應(yīng)對操作者、實驗地點等要素進(jìn)行相關(guān)的驗證。

（2）設(shè)定合理的精密度評價周期，如有條件，建議申請人選擇不同的實驗室進(jìn)行重復(fù)實驗以對室間精密度進(jìn)行評價。

（3）用于精密度評價的質(zhì)控品應(yīng)至少包括三個水平:

①陰性質(zhì)控品：待測物濃度低于試劑盒的臨界值（cut-off value）或背景值較高的零濃度質(zhì)控品，陰性檢出率應(yīng)為100%（n≥20）。

②弱陽性質(zhì)控品：待測物濃度略高于試劑盒的臨界值（cut-off value），陽性檢出率應(yīng)在90%～95%范圍（n≥20）。

③陽性質(zhì)控品：待測物濃度呈中到強(qiáng)陽性，陽性檢出率為100%，且CV≤15%（n≥20）。

另外，建議選擇適量臨床采集的新鮮病人樣本（包括所有樣本類型）作為無靶值質(zhì)控品進(jìn)行精密度評價，以更好地模仿臨床檢測環(huán)境。

6.陽性/陰性參考品

如申報產(chǎn)品有相應(yīng)的國家參考品，則企業(yè)內(nèi)部陽性/陰性參考品應(yīng)參考國家參考品的項目設(shè)置。在不低于國家參考品要求的前提下，申請人可以結(jié)合實際情況設(shè)置合理的內(nèi)部陽性/陰性參考品。對于沒有國家參考品的產(chǎn)品，申請人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗證的實際情況自行設(shè)定企業(yè)內(nèi)部參考品，陽性參考品應(yīng)著重考慮抗體滴度要求，陰性參考品則主要涉及對分析特異性（交叉反應(yīng)）的驗證情況。

申請人應(yīng)對內(nèi)部陽性/陰性參考品的來源、抗體滴度等信息進(jìn)行精確的實驗驗證，并提交詳細(xì)的驗證資料。

7.鉤狀（HOOK）效應(yīng)

須采用高滴度的病原體特異性IgM抗體的血清進(jìn)行梯度稀釋后由低濃度至高濃度開始檢測，每個梯度的稀釋液重復(fù)3～5份，對鉤狀效應(yīng)進(jìn)行合理的驗證。建議在產(chǎn)品說明書上明示對鉤狀效應(yīng)的研究結(jié)果。

（八）參考值（范圍）確定資料

重點提交對申報試劑陰性/灰區(qū)/陽性等結(jié)果判斷的臨界值確定的實驗研究資料，應(yīng)包括具體的試驗方案、評價標(biāo)準(zhǔn)、統(tǒng)計學(xué)分析、研究數(shù)據(jù)等研究資料。建議采用受試者工作特征曲線（ROC）的分析方式來選擇確定合理的臨界值，如實驗結(jié)果分析存在灰區(qū)（equivocal zone），則應(yīng)明確灰區(qū)建立的基礎(chǔ)。臨界值建立的樣本來源選擇應(yīng)考慮到地域性、年齡、不同生理狀態(tài)等因素的影響，并明確臨界值在不同的樣本類型是否有差異。對臨界值建立后所產(chǎn)生的臨床靈敏度和特異性進(jìn)行充分判斷，使產(chǎn)生假陰性或假陽性結(jié)果的可能性均降至最低。

（九）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實時穩(wěn)定性、高溫加速破壞穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性及開瓶穩(wěn)定性（如涉及）等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

考慮到低溫條件下長時間保存可能造成病原體特異性IgM抗體的活性減弱，申請人應(yīng)對樣本穩(wěn)定性進(jìn)行合理的驗證，主要是對冷藏和冷凍兩種條件下的有效期進(jìn)行驗證，以確認(rèn)不同類型樣本的短期、長期保存條件及效期。需要冷凍保存的樣本應(yīng)對凍融次數(shù)（重要指標(biāo)）進(jìn)行合理的驗證。某些用于防腐、冷凍用途或起穩(wěn)定保護(hù)作用的添加劑（如疊氮化物）可能會對IgM抗體的檢測造成影響，如涉及，請對該添加劑的影響進(jìn)行合理驗證。

另外，如果要用于加熱樣本（如熱滅活）的檢測，則應(yīng)對加熱前后的病原體特異性IgM抗體陽性及陰性樣本進(jìn)行加熱因素的干擾驗證。方法為對臨界值附近的至少10份弱陽性加熱和未加熱樣本進(jìn)行對比檢測，比較檢測結(jié)果的差異;對至少10份陰性加熱和未加熱的樣本進(jìn)行對比檢測，比較檢測結(jié)果的差異。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進(jìn)行詳細(xì)說明。

（十）臨床試驗資料

1. 研究方法

（1）對于已有同類產(chǎn)品上市的試劑臨床研究，選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為參比試劑，采用擬申報產(chǎn)品（以下稱考核試劑）與之進(jìn)行對比試驗研究，證明本品與已上市產(chǎn)品等效或優(yōu)于已上市產(chǎn)品。考慮到試劑盒的預(yù)期用途，陽性樣本中應(yīng)包括一定量的新鮮樣本比例。

另外，申請人還應(yīng)選擇不少于30例、感染急性期患者采集的樣本進(jìn)行考核試劑與病原體分離培養(yǎng)鑒定方法的比較研究，以確定申報試劑檢測結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)方法比較的符合率并以此判斷其臨床靈敏度和特異性。如果病原體分離培養(yǎng)鑒定的方法不可行也可以采用其他用于感染急性期判斷的方法進(jìn)行比對研究，例如：病原體IgG抗體的血清學(xué)轉(zhuǎn)換（動態(tài)監(jiān)測2份或以上的血清IgG，恢復(fù)期與急性期比較IgG呈4倍以上升高）、病原體核酸檢測或直接抗原檢測等方法，對于病原體感染急性期的判斷應(yīng)密切結(jié)合患者的臨床診斷綜合進(jìn)行。

（2）對于無同類產(chǎn)品上市的申報試劑的臨床研究，則必須選擇病原體感染檢測的金標(biāo)準(zhǔn)方法并結(jié)合臨床診斷進(jìn)行相應(yīng)的對比試驗研究，如病原體分離培養(yǎng)鑒定、病原體IgG抗體的血清學(xué)轉(zhuǎn)換、病原體核酸檢測或直接抗原檢測等方法。

2.臨床研究單位的選擇

申請人在國內(nèi)不同區(qū)域選擇臨床單位，盡量使各單位的臨床樣本有一定的區(qū)域代表性;臨床研究單位應(yīng)具有特定病原體感染疾患診療、病原體分離培養(yǎng)鑒定方法或分子生物學(xué)方法檢測的優(yōu)勢，實驗操作人員應(yīng)有足夠的時間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評價方案。在整個實驗中，考核試劑和參比方法都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。

3.臨床試驗方案

臨床試驗實施前，研究人員應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計科學(xué)合理的臨床研究方案。各臨床研究機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預(yù)定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應(yīng)在臨床研究機(jī)構(gòu)的實驗室內(nèi)并由本實驗室的技術(shù)人員操作完成，申報單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實驗進(jìn)程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。

試驗方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床研究都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結(jié)果時應(yīng)采用盲法以保證試驗結(jié)果的客觀性。各研究單位選用的參比試劑應(yīng)保持一致，以便進(jìn)行合理的統(tǒng)計學(xué)分析。另外，考核試劑的樣本類型不應(yīng)超越參比試劑對樣本類型的檢測要求，如果選擇了參比試劑適用樣本類型以外的樣本，則應(yīng)采用病原體分離培養(yǎng)鑒定或其他合理方法對額外的樣本類型進(jìn)行驗證。

4.病例選擇及樣本類型

臨床試驗應(yīng)選擇具有特定病原體感染癥狀/體征、相似癥狀或有密切接觸史等人群作為研究對象。企業(yè)在建立病例納入標(biāo)準(zhǔn)時，應(yīng)考慮到不同人群的差異，盡量覆蓋各類適用人群。在進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計分析時，除總體病例數(shù)的要求外，建議對各類人群分層進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析?？紤]到大樣本統(tǒng)計學(xué)的要求，臨床研究中病原體特異性IgM抗體的陽性樣本例數(shù)以不少于120例為宜。對于陰性病例的選擇，也應(yīng)考慮到交叉反應(yīng)的需要，對靶病原體之外的其他病原體感染急性期的患者樣本進(jìn)行檢測，以從臨床角度考察其分析特異性。

5.統(tǒng)計學(xué)分析

對臨床試驗結(jié)果的統(tǒng)計應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計方法，如檢測結(jié)果一致性分析、受試者工作特征（ROC）曲線分析、陰性/陽性符合率等。對于本類產(chǎn)品對比實驗的等效性研究，常選擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進(jìn)行四格表卡方或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結(jié)果的一致性，統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)可以證明兩種方法的檢測結(jié)果無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。在臨床研究方案中應(yīng)明確統(tǒng)計檢驗假設(shè)，即評價考核試劑與參比試劑是否等效的標(biāo)準(zhǔn)。

6.結(jié)果差異樣本的驗證

在數(shù)據(jù)收集過程中，對兩種試劑檢測結(jié)果明顯不一致的樣本，應(yīng)采用“金標(biāo)準(zhǔn)”方法或臨床上普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的第三種同類試劑（國內(nèi)已上市）進(jìn)行復(fù)核，同時結(jié)合患者的臨床病情對差異原因及可能結(jié)果進(jìn)行分析。如果申報試劑與參比試劑的檢測結(jié)果顯示不一致樣本均是位于二者的臨界值附近且例數(shù)很少（如低于總例數(shù)的1%），則對不一致原因作簡要分析即可，不須進(jìn)行第三方復(fù)核。注意，如果有必要選擇第三方試劑復(fù)核，建議先采用第三方試劑對一定數(shù)量的申報試劑和參比試劑檢測結(jié)果一致的樣本（包括陽性和陰性結(jié)果）進(jìn)行檢測，以對第三方試劑選擇的合理性進(jìn)行評估。

7. 臨床試驗總結(jié)報告撰寫

根據(jù)《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》（國食藥監(jiān)械〔2007〕240號）的要求，臨床試驗報告應(yīng)該對試驗的整體設(shè)計及各個關(guān)鍵點給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對整個臨床試驗實施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法。建議在臨床總結(jié)報告中對以下內(nèi)容進(jìn)行詳述。

（1）臨床試驗總體設(shè)計及方案描述

①臨床試驗的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。

②病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)、不同人群的預(yù)期選擇例數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)。

③樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。

④統(tǒng)計學(xué)方法、統(tǒng)計軟件、評價統(tǒng)計結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。

（2）具體的臨床試驗情況

①申報試劑和參比試劑的名稱、批號、有效期等信息。

②對各研究單位的病例數(shù)、人群分布情況進(jìn)行綜合，建議以列表或圖示方式給出具體例數(shù)及百分比。

③質(zhì)量控制，試驗人員培訓(xùn)、質(zhì)控品檢測情況，對檢測精密度、質(zhì)控品測量值的抽查結(jié)果評估。

④具體試驗過程，樣本檢測、數(shù)據(jù)收集、樣本長期保存、結(jié)果不一致樣本的校驗等。

（3）統(tǒng)計學(xué)分析

①數(shù)據(jù)預(yù)處理、差異數(shù)據(jù)的重新檢測或第三方驗證以及是否納入最終數(shù)據(jù)統(tǒng)計、對異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對方案的修改。

②定性結(jié)果的一致性分析

陽性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%（或99%）的置信區(qū)間。以交叉表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進(jìn)行四格表卡方或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結(jié)果的一致性。另外考慮到對不同樣本類型以及不同人群的檢測結(jié)果可能存在一定差異，故建議對不同樣本類型及不同人群分別進(jìn)行統(tǒng)計分析， 以對考核試劑的臨床性能進(jìn)行綜合分析。

（4）討論和結(jié)論

對總體結(jié)果進(jìn)行總結(jié)性描述并簡要分析試驗結(jié)果，對本次臨床研究有無特別說明，最后得出臨床試驗結(jié)論。

四、名詞解釋

1.分析特異性（analytical Specificity）：測量程序只測量被測量物的能力。分析特異性用于描述檢測程序在樣本中有其他物質(zhì)存在時只測量被測量物的能力。通常以一個被評估的潛在干擾物清單來描述，并給出在特定醫(yī)學(xué)相關(guān)濃度值水平的分析干擾程度。

注：潛在干擾物包括干擾物和交叉反應(yīng)物。

2.精密度（precision）：在規(guī)定條件下，相互獨立的測試結(jié)果之間的一致程度。精密度的程度是用統(tǒng)計學(xué)方法得到的測量不精密度的數(shù)字形式表示，如標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）。

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