附件：遺傳性耳聾相關基因突變檢測試劑注冊技術審查指導原則（2021年第4號）.doc

遺傳性耳聾相關基因突變檢測試劑注冊技術審查指導原則
（2021年第4號）

本指導原則旨在指導注冊申請人對遺傳性耳聾相關基因突變檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門對注冊申報資料的技術審評提供參考。

本指導原則是對遺傳性耳聾相關基因突變檢測試劑的一般要求，申請人應依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細化。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，也不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細的研究和驗證資料，相關人員應在遵循法規(guī)的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規(guī)和標準的不斷完善以及科學技術的不斷發(fā)展，本指導原則相關內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。

一、適用范圍

耳聾是一種常見的感覺障礙性疾病，耳聾病因復雜，目前研究認為約60％重度耳聾的發(fā)病與遺傳有關。遺傳性耳聾主要涉及四種遺傳方式：常染色體隱性、常染色體顯性、線粒體遺傳、性染色體連鎖遺傳。按耳聾和言語功能發(fā)育的關系可分為語前聾和語后聾。言語功能發(fā)育之前發(fā)生的重度或極重度耳聾稱為語前聾，在言語功能發(fā)育完成后開始的耳聾稱為語后聾。一般來說，常染色體隱性遺傳性耳聾表現(xiàn)為先天性聾或語前聾，常染色體顯性遺傳耳聾多表現(xiàn)為語后聾或漸進性聽力下降。藥物性耳聾、大前庭水管綜合征等遺傳性耳聾也可表現(xiàn)為后天遲發(fā)性。遺傳性耳聾根據(jù)是否伴有多個系統(tǒng)病變分為綜合征型耳聾與非綜合征型耳聾，綜合征型耳聾一般除了聽力損傷外還伴有其他器官系統(tǒng)異常，表現(xiàn)為多種表型，與非綜合征型耳聾相比其遺傳背景更為復雜。目前遺傳性耳聾中約有30%為綜合征型耳聾，70%為非綜合征型耳聾。其中，非綜合征型常染色體隱性耳聾最常見，約占80%。

耳聾具有顯著的遺傳異質(zhì)性，不同的種族中常見的致聾基因不同，進化過程造成了人種間遺傳差異、人群遷徙和血源融合又導致了局部地區(qū)人群遺傳背景的復雜化，中國耳聾人群中基因突變熱點、突變譜、表型與基因型對應性與其他人種耳聾人群存在一定差異。在我國，約70%的遺傳性耳聾變異來自于GJB2、SLC26A4、GJB3及線粒體DNA 12SrRNA 等4個常見致聾基因。目前常規(guī)建議進行的檢測位點主要涉及4個基因的9個突變位點，具體為GJB2基因：c.35delG、c.235delC、c.176-191dell6和c.299-300delAT；SLC26A4基因：c.2168A>G和c.919-2A>G（IVS7-2A>G）；GJB3基因：c.538C>T ；12SrRNA基因：m.1494C>T和m.1555A>G。各位點相關情況如下：

GJB 2基因： GJB2基因位于人類染色體13q11-12，其基因短小，包含2個外顯子，編碼226個氨基酸，編碼縫隙連接蛋白26，耳蝸縫隙連接蛋白的作用是維持內(nèi)耳鉀離子平衡，同時在內(nèi)耳的生理功能中發(fā)揮非常復雜的作用，包括參與第二信使的轉(zhuǎn)運及耳蝸內(nèi)電位的產(chǎn)生。目前已發(fā)現(xiàn)的GJB2基因致聾突變超過200個，是迄今為止在多個人種中最常見的致聾基因，國外研究認為常染色體隱性遺傳性耳聾患者中，約有50%由GJB2基因突變引起。但是該基因致聾比例在不同人種中存在差異。其主要突變方式為缺失，其中，c.235delC是中國人群中發(fā)生頻率最高的突變，其他位點還包括c.299-300delAT、c.176-191del16、c.35delG等。

SLC26A4基因：又稱PDS基因，位于人類染色體7q31,含有21個外顯子，編碼離子轉(zhuǎn)運相關蛋白，在機體離子成分平衡的維持中發(fā)揮重要作用。該基因突變是導致前庭水管擴大（EVA）的責任基因，EVA是與兒童感音神經(jīng)性聾相關的最常見的內(nèi)耳畸形，大部分EVA患者變現(xiàn)為非綜合征型耳聾（DFNB4），少部分同時合并甲狀腺腫大，稱Pendred綜合征。對于該類患者往往變現(xiàn)為遲發(fā)性、漸進性，頭部碰撞、感冒等會引起顱內(nèi)壓變化的活動都可能會引起聽力下降。在我國，約96%的前庭水管擴大患者由SLC26A4基因突變導致，中國耳聾人群中該基因突變檢出率為20.35%，目前發(fā)現(xiàn)的該基因致病突變眾多，突變位點及突變頻率存在地域和種族差異，在中國c.919-2A>G、c.2168A>G為攜帶頻率最高的SLC26A4基因熱點突變，其次還有c.1229C>T、c.1975G>C、c.1174A>T等。突變等位基因按外顯子排名由高到低為：外顯子7+8、外顯子10、外顯子19、外顯子17、外顯子15。發(fā)生在上述外顯子上突變約占90.61%。

GJB3基因：位于染色體1p35-p33，編碼縫隙連接蛋白31，是國內(nèi)發(fā)現(xiàn)、克隆并鑒定的第一個耳聾相關基因，可以引起常染色體顯性或者隱性遺傳。主要突變形式有c.538C>T的無義突變和c.547G>A的錯義突變，其可能與語后高頻聽力下降相關，目前國外對GJB3基因突變引起耳聾的報道較少。

線粒體DNA（mtDNA）突變：mtDNA是存在于細胞質(zhì)中、獨立于核染色體的基因組，由于受精卵所含有的mtDNA來自于卵子的細胞質(zhì)，因此主要為母系遺傳。在細胞復制過程中mtDNA突變隨機分配，母親-子代突變比例可能差異較大，mtDNA存在狀態(tài)閾值，即只有突變型DNA達到一定負荷率或mtDNA功能缺陷到一定程度才會產(chǎn)生相應表型。由mtDNA突變而引起的耳聾包括綜合征型耳聾和非綜合征型耳聾，其中mtDNA 12SrRNA上的m.1555A>G、m.1494C>T突變是氨基糖苷類藥物致聾的易感位點，突變攜帶者對氨基糖甙類藥物異常敏感，低劑量使用該類藥物就可能會出現(xiàn)耳鳴，甚至嚴重的聽力下降。此外，其他mtDNA突變還可能引起綜合征型耳聾，例如母系遺傳糖尿病伴耳聾等。

除上述列舉的代表性基因突變外，至今已有眾多其他耳聾相關的致病基因被克隆或鑒定，但還有很多耳聾表型的致病基因不清楚。隨著科學發(fā)展，可能發(fā)現(xiàn)其他意義明確的耳聾表型相關基因和突變位點并應用于臨床。

目前，遺傳性耳聾基因突變檢測在遺傳性耳聾的輔助診斷以及新生兒遺傳性耳聾基因突變篩查等領域有重要意義。例如通過對具有耳聾癥狀和/或體征人群，以及其他需要進行耳聾基因突變檢測的人群，如有耳聾家族史的人群等進行耳聾基因突變的檢測可用于遺傳性耳聾的輔助診斷；對新生兒進行遺傳性耳聾基因突變篩查，可作為常規(guī)物理聽力篩查的補充，特別是可發(fā)現(xiàn)常規(guī)物理聽力篩查無法檢出的藥物性致聾基因攜帶者和遲發(fā)性耳聾基因攜帶者，從而進行早期干預和指導等。

遺傳性耳聾的診斷是一項復雜的工作，診斷流程包含常規(guī)診斷的病史采集、體格檢查、輔助檢查、對先證者及家系成員進行家系分析和遺傳性檢測等。

結(jié)合該類產(chǎn)品臨床使用的實際情況，本指導原則的預期用途可為：用于體外定性檢測人外周靜脈血或干血斑樣本中人基因組DNA的遺傳性耳聾基因突變，用于遺傳性耳聾的輔助診斷，或新生兒遺傳性耳聾相關基因突變的篩查，具體預期用途應與產(chǎn)品臨床驗證相對應。

耳聾基因突變檢測方法眾多，國內(nèi)應用較多的有高通量測序、飛行時間質(zhì)譜、限制性酶內(nèi)切法、熒光PCR法、微陣列芯片技術、PCR+導流雜交法等，其具體的檢測原理存在差異，目前以僅包含PCR擴增反應或后續(xù)結(jié)合探針雜交反應進行位點檢測的試劑盒較為常見，因此，本指導原則的技術要求適用于主要基于PCR擴增類（如熒光PCR法、微陣列芯片技術、PCR+導流雜交法）的檢測試劑，對于其他檢測技術（如PCR-質(zhì)譜、高通量測序），申請人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對不適用部分進行或補充其他的評價和驗證，但需闡述不適用的理由，并驗證替代方法的科學合理性。

本指導原則適用于進行首次注冊申報和相關許可事項變更的產(chǎn)品。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預期用途、產(chǎn)品描述、有關生物安全性的說明、研究結(jié)果的總結(jié)評價以及國內(nèi)外同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容。其中，需注意以下內(nèi)容：

1.應明確檢測位點的臨床意義，尤其是對于新突變位點，應提交關于新增位點的臨床意義的行業(yè)認可證據(jù)（如國內(nèi)相關指南或?qū)＜夜沧R）及支持性文獻等，詳述位點導致耳聾作用機制、遺傳方式、突變后果、突變檢出率以及中國人群數(shù)據(jù)等。

如新突變位點的臨床意義未獲行業(yè)認可，申請人應提供該基因新突變位點與耳聾表型相關的遺傳學證據(jù)，包括但不限于：耳聾患者和正常人群的等位基因突變頻率、耳聾患者家系共分離、生物信息學分析、權威數(shù)據(jù)庫的信息等基于中國人群的充分的研究數(shù)據(jù)，以及基因突變和表型關系評估的資料，新突變位點應具有明確致病性。

2.詳述檢測原理、引物探針與檢測位點對應關系以及結(jié)果判斷等。

3.同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應著重從方法學、檢驗原理、檢測的突變類型以及臨床意義等方面詳細說明申報產(chǎn)品與目前市場上已獲批準的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。

綜述資料應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（原總局令第5號，以下簡稱《辦法》）和《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（原總局公告2014年第44號），以下簡稱《44號公告》的要求。

（二）主要原材料的研究資料

主要原材料研究資料包括主要反應成分、對照品/質(zhì)控品及企業(yè)參考品的研究資料。

1.此類產(chǎn)品的主要反應成分一般包括人基因組核酸提取/純化試劑、檢測所需引物、探針、酶、dNTPs以及雜交反應過程（如適用）中涉及的其他主要原材料（如標記用酶等）。申請人應提交各組分試劑中涉及的全部主要原材料的來源、篩選研究過程、制備過程、質(zhì)量控制標準及檢驗資料等。如為申請人自制，應提交詳細制備方法及過程，并應保證工藝相對穩(wěn)定；如為外購，應注意明確原材料的供應商，并應提交供應商提供的原材料質(zhì)量檢定報告。

1.1核酸提取/純化試劑（如有）的主要組成、原理介紹及相關的驗證資料。

1.2引物、探針

申請人應詳述引物、探針的設計原則、靶基因座位選擇，同時應提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對應情況，建議設計多套引物探針以供篩選，針對待測位點檢測準確性、特異性等功能性指標進行評價，選擇最佳設計，注意應提交詳細的篩選過程研究數(shù)據(jù)及分析過程。

申請人應針對選定的引物、探針原材料進行質(zhì)量評價，一般包括：序列準確性、純度（HPLC等）、濃度、探針熒光標記基團的激發(fā)波長和發(fā)射波長（如適用），以及功能性試驗等，并依據(jù)評價結(jié)果建立合理的質(zhì)量標準。

1.3酶

酶包括DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）等。申請人應針對各種酶的活性進行驗證，提交功能性試驗資料，并確定酶的質(zhì)量標準。

DNA聚合酶應具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具有熱穩(wěn)定性。UDG/UNG應具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性。

1.4脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）

包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP；應提交對其純度、濃度等的驗證資料，以及功能性試驗資料，并確定質(zhì)量標準。

1.5雜交用其他主要原材料（如適用）

根據(jù)具體產(chǎn)品提交雜交反應涉及的其他主要原材料的選擇及驗證資料，例如標記用酶/生物素、雜交液試劑中關鍵原料等，明確其來源及相應的技術指標要求。

2.對照品/質(zhì)控品

試劑盒應根據(jù)檢測原理設置各種對照品（質(zhì)控品）、質(zhì)控探針（如適用）實現(xiàn)對產(chǎn)品整個反應體系的有效監(jiān)控。對照品通常包含陽性對照、陰性和/或空白對照，其中陽性對照一般應至少包括代表性的突變位點和突變類型。對于PCR擴增后需要采用探針雜交進行位點檢測的試劑，還應建立對雜交過程的質(zhì)控體系。

如該類產(chǎn)品所采用的方法學和檢驗原理顯示：無論檢測何種樣本（野生型、雜合/異質(zhì)突變和純合/均質(zhì)突變），其反應體系均可報出核酸序列結(jié)果，均可對檢測的假陰性結(jié)果進行質(zhì)量控制，則無需另外設置內(nèi)標；否則，試劑盒應另外設置內(nèi)標。

對照品可采用人基因組DNA、細胞系提取的基因組DNA或質(zhì)粒等。陰性/空白對照應參與樣本核酸的平行提取。申請人應提供對照品來源、選擇、制備、基因序列確認等的詳細研究數(shù)據(jù)，并對其檢測結(jié)果做出明確的范圍要求。質(zhì)控探針/點涉及的主要原材料參照前述1.2及1.5進行。

3.企業(yè)參考品

企業(yè)參考品主要包括陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品和精密度參考品等。申請人應提交企業(yè)參考品的原料來源、選擇、制備方法、基因序列確認及檢驗標準的詳細研究資料等。

3.1陽性參考品：陽性參考品應包含所有位點的突變型（至少包含雜合型），參考品建議采用臨床樣本、細胞系或臨床樣本提取的基因組DNA制備，需提交詳細的細胞系構建資料，樣本應明確其來源及型別確認資料。

3.2陰性參考品：建議包括野生型臨床樣本，可能產(chǎn)生交叉反應的同源序列（如有）以及檢測范圍外其他檢測位點。參考品樣本要求參照陽性參考品，如涉及納入檢測范圍外其他罕見型別也可采用質(zhì)粒。

3.3檢測限參考品：濃度水平可選擇最低檢測限附近水平，應包含所有位點的突變型（至少包含雜合型），對于線粒體突變，還應包含最低檢出異質(zhì)性比例。參考品樣本要求參照陽性參考品進行。

3.4精密度參考品：建議至少包括低濃度水平的代表性的突變位點和突變類型（覆蓋所有突變基因型）。參考品樣本要求參照陽性參考品進行。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應體系的研究資料

主要生產(chǎn)工藝研究資料應提交工作液配制（引物、探針濃度、酶濃度、dNTPs濃度、緩沖液離子濃度等）及其分裝和凍干（如有）、熒光標記（如有）、雜交芯片/雜交膜的制備（如涉及）、雜交過程所需的雜交液、顯色液及相關緩沖液（如涉及）等工藝過程中各參數(shù)詳細的選擇及確認依據(jù)。生產(chǎn)過程應對關鍵參數(shù)進行有效控制，可采用流程圖方式描述生產(chǎn)工藝，標明關鍵工藝質(zhì)控步驟，并詳細說明該步驟的質(zhì)控方法及質(zhì)控標準。

反應體系研究資料應提交反應條件的選擇確定過程，包括樣本采集、預處理（如有）、樣本用量、試劑用量、PCR反應體系、雜交體系以及其他檢測過程中涉及的反應條件/參數(shù)等的確定。如申報產(chǎn)品包含核酸分離/純化試劑，應提交對核酸分離/純化過程進行的研究資料。

同時反應體系研究資料中應提供可檢測的總核酸濃度范圍的研究/確認資料。即建議申請人還應對可準確檢出的人基因組DNA濃度上限進行研究驗證。

不同適用機型的反應條件如有差異應分別提交。

（四）分析性能評估資料

申請人應針對下述各項分析性能提交詳細的評估資料，包括試驗地點、適用儀器、試劑規(guī)格、批號、試驗方法、試驗樣本（類型、來源、數(shù)量、處理方法、基因型和濃度確認等）、可接受標準、統(tǒng)計方法、試驗數(shù)據(jù)及結(jié)論等。分析性能評估的實驗方法可以參考國內(nèi)外有關體外診斷產(chǎn)品性能評估的指導原則。

如試劑用于不同適用機型，需要在不同機型上分別進行性能評估。

1.適用的樣本類型

如果試劑適用于多種樣本類型，應采用合理方法對每種樣本類型及添加劑（如抗凝劑）進行適用性的研究確認。對于不同的樣本類型（如外周血和干血斑）應分別提交相應的分析性能評估資料。

2.核酸提取/純化性能

在進行靶核酸檢測前，應有適當?shù)暮怂崽崛?純化步驟。該步驟應最大量分離和純化目的核酸并盡可能去除PCR抑制物。無論檢測試劑是否含有核酸提取/純化組分，申請人都應對配套使用的核酸提取/純化方法的提取效率和提取核酸純度、濃度等做充分的研究驗證，并評價該方法能否滿足該類產(chǎn)品的要求。不同樣本類型應分別進行核酸提取/純化性能的研究驗證。

3.檢測準確性

應采用臨床樣本驗證該類產(chǎn)品的檢測準確性，樣本類型與說明書聲稱的樣本類型一致，應包含所有位點突變型，至少包含雜合型樣本，盡量納入純合型樣本，對于線粒體突變，應盡量納入異質(zhì)型。同時建議考察對復合突變樣本/人工構建質(zhì)粒的檢出能力。

提供所有試驗用樣本來源、型別確認等試驗資料。

4.最低檢出限

該類產(chǎn)品的最低檢測限可定義為：在滿足一定的檢測準確性和精密度的條件下，能夠檢出目標序列的最低人基因組DNA的濃度，如包含線粒體突變，還應考察特定核酸濃度下的最低可檢出的突變比例（異質(zhì)性比例）。

最低檢測限確立：可采用常見突變類型的臨床樣本，對人基因組DNA樣本梯度稀釋，對每個濃度水平重復檢測3～5次，可通過以100%可檢出的最低濃度作為估計檢測限，然后在此濃度附近制備若干濃度梯度樣本，每個濃度至少重復20次檢測，將具有95%檢出率水平濃度作為最低檢測限。

最低檢出限的驗證：應對試劑盒涵蓋的所有的檢測位點進行檢出能力的驗證，至少包含所有位點雜合型臨床樣本。

對線粒體突變還應考察研究特定核酸濃度下的最低突變比例（異質(zhì)性比例），研究時可采用均質(zhì)突變與野生型混合制備系列不同異質(zhì)性比例樣本，考察在各固定核酸濃度下不同異質(zhì)性比例的檢出情況，并確定出可滿足最低核酸濃度下可檢出的最低異質(zhì)性比例，應至少包含20次重復檢測，達到95%的檢出率。

應提供所有試驗用樣本來源、型別及濃度（含異質(zhì)性比例）確定的方法等試驗資料。

5.分析特異性

分析特異性受干擾和交叉反應的影響。申請人應對樣本中常見的干擾物質(zhì)和可能引起交叉反應的物質(zhì)進行研究。

5.1交叉反應：應針對野生型、非人類基因組、核酸序列相近或具有同源性、以及其他易引起交叉反應的突變類型序列（如待測位點附近的其他突變位點、其他耳聾基因等）進行交叉反應研究。同時申請人還應驗證檢測范圍內(nèi)各基因及突變位點間的交叉干擾。申請人應提交交叉反應基因的選擇依據(jù)（如耳聾基因背景、發(fā)病情況），說明交叉反應樣本的來源/制備方法、核酸序列確認方法，提交詳細的驗證資料。

5.2干擾試驗：應針對可能的內(nèi)源和外源性干擾物進行研究。內(nèi)源干擾物主要涉及血脂、膽紅素、血紅蛋白和白蛋白、膽固醇等，外源干擾物主要包括血液樣本采集可能用到的抗凝劑、常用藥物干擾等。針對不同樣本類型，建議分別進行相應的干擾研究。

干擾試驗可采用配對比對的方式，比較干擾樣本和不包含或含正常濃度水平干擾物樣本檢測結(jié)果間差異?？赏ㄟ^在臨床樣本中人工添加干擾物質(zhì)的方式，評價干擾物質(zhì)對目標序列檢測的影響，也可直接采集暴露于干擾因素后的受試者樣本，進行干擾試驗評價。對于線粒體突變，建議考察最低異質(zhì)性比例下的干擾。建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行評價；如有干擾，應確定不產(chǎn)生干擾的最高濃度。

6.精密度

精密度評價應至少包含野生型及常見代表性突變位點和突變類型（覆蓋所有突變基因）的臨床樣本。試驗操作完全按照說明書執(zhí)行，包含核酸提取/純化等步驟（如有）。此外，如產(chǎn)品包含多個反應管，建議每個反應管均應進行精密度研究。精密度評價需滿足如下要求：

6.1對可能影響檢測精密度的主要因素進行驗證，除檢測試劑本身外，還包括分析儀器、操作者、地點、時間、檢測輪次和試劑批次等。

6.2設定合理的精密度評價周期，對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應選擇不同的實驗室進行重復實驗以對室間重復性進行評價。

6.3用于精密度評價的臨床樣本建議包含最低檢出限水平和中/高濃度。最低檢測限水平下，檢出率應≥95%（n≥20）;中/高濃度水平下，檢出率應≥100%（n≥20）。

6.4申請人應對精密度指標評價標準做出合理要求，精密度指標可設置為CV等（如有）。

7.提供企業(yè)參考品驗證資料：根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設置情況，采用三批產(chǎn)品對企業(yè)參考品進行檢驗并提供詳細的實驗數(shù)據(jù)。

（五）陽性判斷值確定資料

建議申請人采用一定量的臨床樣本，結(jié)合產(chǎn)品特性采用受試者工作曲線或其他合理方法對申報產(chǎn)品用于結(jié)果判斷的標準/臨界值進行研究確認。陽性判斷值研究應涵蓋野生型和所有檢測位點的突變型（至少納入雜合型）。同時應提供內(nèi)標（如適用）的研究資料。

對于某些檢測方法學，陽性判斷值研究可能不適用，申請人應說明理由。

應提交詳細的研究方案（包含臨床樣本的來源、型別確認等資料）、試驗數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析過程。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要包括申報產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究和適用樣本的穩(wěn)定性研究兩部分。前者主要包括申報產(chǎn)品的實時穩(wěn)定性、開瓶/復溶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制的研究等；后者則是指適用樣本的保存條件和保存時間等的研究。如核酸提取液可保存，還需對核酸提取液的保存條件和保存時間進行研究。

實時穩(wěn)定性研究應采用至少三批樣品在實際儲存條件下選取多個時間點進行產(chǎn)品性能評價，應持續(xù)進行至成品有效期后，從而確定產(chǎn)品保存條件和有效期。

（七）臨床評價資料

臨床試驗應滿足《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號）的要求，如相關法規(guī)、文件有更新，臨床試驗應符合更新后的要求。下面僅說明該類產(chǎn)品臨床試驗中應關注的重點問題。

1．針對“遺傳性耳聾的輔助診斷（遺傳診斷）”預期用途

1.1臨床試驗機構及人員

申請人應根據(jù)產(chǎn)品特點及預期用途，綜合不同地區(qū)人種和流行病學背景等因素，選擇不少于3家（含3家）符合法規(guī)要求的臨床試驗機構開展臨床試驗。

1.2臨床試驗適用人群和樣本類型

具有耳聾癥狀和/或體征人群，以及其他需要進行耳聾基因突變檢測的人群，如有耳聾家族史的人群等。

臨床試驗所用樣本一般為抗凝外周血樣本。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應分別滿足申報試劑說明書、對比試劑說明書（如適用）及第三方試劑說明書（如適用）的相關要求。

如申報產(chǎn)品的樣本類型包括抗凝外周血以外的其他樣本，如干血斑，請確認該樣本類型的預期用途是否為遺傳性耳聾的輔助診斷，入組人群是否與其預期用途一致；如不同，則應選擇其適用人群進行相應預期用途的臨床試驗。

1.3臨床試驗方法

1.3.1已有同類產(chǎn)品上市的申報產(chǎn)品

對于已批準的遺傳性耳聾相關基因突變位點，原則上應選擇已上市同類產(chǎn)品作為對比試劑，對比試劑應涵蓋考核試劑的檢測位點，以此評價申報產(chǎn)品的臨床檢測性能。

1.3.2無同類產(chǎn)品上市的申報產(chǎn)品

1.3.2.1如新突變位點的臨床意義已獲行業(yè)認可（如：國內(nèi)相關指南或?qū)＜夜沧R），且上述認可基于充分的中國人群的臨床研究數(shù)據(jù)，則臨床試驗可選擇參考方法（如一代測序法）作為對比方法，評價新突變位點的臨床檢測性能。除此之外，還應提交新位點臨床意義已獲行業(yè)認可的相關證據(jù)，該部分資料可在其他臨床證據(jù)中提交。

1.3.2.2如新突變位點的臨床意義未獲行業(yè)認可，申請人首先應提供該基因新突變位點與耳聾表型相關的遺傳學證據(jù)，包括但不限于：耳聾患者和正常人群的等位基因突變頻率、耳聾患者家系共分離、生物信息學分析、權威數(shù)據(jù)庫的信息等基于中國人群的充分的研究數(shù)據(jù)，對基因突變和表型的關系進行評估，具有明確致病性的基因突變位點方可納入。

臨床試驗應包括兩個目的，新突變位點的臨床檢測性能評價和臨床意義評價。新突變位點的臨床檢測性能評價可參考1.3.2.1；新突變位點的臨床意義評價應分析基因型與臨床表型的相關性，基因型與表型的相關性可通過隨訪或其他臨床驗證資料來證明。建議同時對所檢出攜帶新突變位點的耳聾患者進行家系分析。

1.4最低樣本量和陽性例數(shù)

臨床試驗樣本量應采用適當?shù)慕y(tǒng)計學方法進行估算，并詳細描述所使用統(tǒng)計方法及各參數(shù)的確定依據(jù)。

臨床檢測性能評價的樣本量估算可分為以下幾種情況。

建議采用單組目標值法分別估算臨床試驗的最低樣本量，通過陽性符合率和陰性符合率來分別計算所需陽性樣本和陰性樣本的例數(shù)，同時考慮脫落情況，估算最低樣本總量。陽性符合率和陰性符合率的目標值（臨床可接受的最低標準）建議均不低于95%。

對于常見突變位點，其陽性總例數(shù)應具有統(tǒng)計學意義，建議納入一定的純合突變（如GJB2的c.235delC、SLC26A4的c.919-2A>G等）。

對于罕見突變位點，陽性樣本也應有一定的例數(shù)。

對于同時申報外周血與干血斑兩種樣本類型的產(chǎn)品，其臨床試驗每種樣本類型應單獨統(tǒng)計，滿足上述要求。

2.針對“新生兒遺傳性耳聾基因突變的篩查”預期用途

針對上述預期用途，本指導原則基于目前的認知水平進行了闡述，不盡之處申請人應根據(jù)產(chǎn)品特性，充分考慮申報產(chǎn)品的臨床性能研究需求，設計科學合理的臨床試驗并進行評價。

申請該預期用途的申報產(chǎn)品，其檢測的基因及突變位點，均應為已得到行業(yè)內(nèi)公認的、與遺傳性耳聾具有明確致病性關系的基因位點。新生兒遺傳性耳聾基因突變篩查用途的應用應符合國家及地方衛(wèi)生管理部門的相關規(guī)定。

2.1臨床試驗機構和人員

應選擇至少3家臨床試驗機構。臨床試驗機構的選擇應盡量考慮擬申報產(chǎn)品的特點和預期用途選擇具有相關資質(zhì)的機構（各地衛(wèi)生健康部門指定的進行新生兒耳聾基因篩查的臨床機構）。建議選擇不同地區(qū)的臨床試驗機構開展臨床試驗，且臨床試驗機構應具有相關檢測的優(yōu)勢。操作人員應經(jīng)過相應的培訓，并能熟練操作實驗。機構和人員應遵循《醫(yī)療機構臨床實驗室管理辦法》及其他相關規(guī)定。試驗應處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數(shù)據(jù)的準確性及可重復性。

2.2臨床試驗適用人群和臨床樣本

如預期用途為新生兒遺傳性耳聾基因突變的篩查，則適用人群為新生兒。

臨床試驗所用樣本一般為干血斑樣本。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應符合國家衛(wèi)生健康委員會等相關文件的要求，并滿足產(chǎn)品說明書的要求。

2.3最低樣本量和陽性例數(shù)

臨床試驗應根據(jù)臨床評價標準選擇合適的統(tǒng)計學模型同時結(jié)合適用人群基因突變頻率進行樣本量估算，并在臨床試驗方案中明確樣本量確定的依據(jù)。

根據(jù)臨床發(fā)病率、臨床診治情況及其他因素綜合考慮，對于我國相對常見的遺傳性耳聾突變位點，如GJB2的c.235delC、c.299_300delAT、c.176-191del16，SLC26A4的c.919-2A>G、c.2168A>G、線粒體DNA 12S rRNA的m.1555A>G突變等，應通過前瞻性臨床試驗檢出突變病例，總例數(shù)應滿足統(tǒng)計學要求；其他人群突變率相對更低的突變位點也應盡可能在前瞻性臨床試驗中檢出。

2.4臨床試驗方法

建議臨床試驗采取前瞻性入組病例的形式，考核試劑對所有入組病例進行檢測，病例基因變異狀態(tài)采用臨床參考標準（如：一代測序法）進行確認，評價考核試劑的臨床性能。臨床試驗過程中，對于先天性耳聾患者等，應提供病例的臨床診斷結(jié)果，臨床診斷結(jié)果應有充分的依據(jù)，如采用現(xiàn)有條件下公認的、可靠的、權威的疾病診斷標準，疾病診療指南中明確的疾病診斷方法，行業(yè)內(nèi)的專家共識等。

申請人還應同時選擇已批準上市、臨床普遍認為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品或參考方法作為對比試劑，與考核試劑進行一定例數(shù)的比較研究試驗，以評價考核試劑的臨床準確性。此部分驗證位點應涵蓋申報產(chǎn)品的所有突變位點。此部分研究可使用部分已確診（回顧性）的陽性病例進行研究。應在試驗方案和報告中對病例選擇的方式和原因進行明確的說明。

應針對篩查用途的驗證和準確性驗證，分別進行統(tǒng)計分析。

3.如有其他預期用途，也應設計科學的臨床試驗，提供充分的證據(jù)，證明其預期用途。

4.不同預期用途的通用要求

4.1臨床試驗方法、數(shù)據(jù)及統(tǒng)計分析

4.1.1應在臨床試驗方案或報告中明確申報產(chǎn)品、對比試劑和第三方試劑的試驗方法。

4.1.2臨床試驗數(shù)據(jù)匯總表應以列表方式表示，包括申報產(chǎn)品的結(jié)果、對比試劑的結(jié)果、第三方試劑的檢測結(jié)果（如有）、年齡、性別、臨床診斷以及臨床背景信息（新生兒篩查應提供新生兒聽力篩查結(jié)果。用于輔助診斷時，具有耳聾癥狀和/或體征的人群應提供必要的聽力學及影像學檢查結(jié)果：如聲導抗、ABR和DPOAE，必要時提供CT或MRI結(jié)果）。

4.1.3以四格表分別總結(jié)考核試劑與對比試劑/方法的定性檢測結(jié)果，選擇合適的統(tǒng)計方法進行統(tǒng)計分析。除總體統(tǒng)計外，還要針對每一個突變位點進行統(tǒng)計分析，同時純合突變以及雜合突變（或均質(zhì)突變和異質(zhì)突變）應分別進行統(tǒng)計分析，以驗證考核試劑與對比試劑/方法檢測結(jié)果的一致性。

4.1.4結(jié)果差異樣本的驗證

在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種試劑檢測結(jié)果不一致的樣本，采用合理方法進行復核，并對差異原因進行分析。如無需復核，應說明理由。

4.2臨床試驗方案

各臨床試驗機構的方案制定應基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床試驗機構的實驗室內(nèi)并由該實驗室的技術人員操作完成，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉實驗進程。

試驗方案應確定嚴格的入選/排除標準，任何已入選的樣本被排除出臨床試驗都應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程和結(jié)果判定時，應采用盲法以保證試驗結(jié)果的客觀性。各臨床試驗機構選用的對比試劑/方法應保持一致，以便進行合理的統(tǒng)計學分析。另外，申報產(chǎn)品的樣本類型不應超越對比試劑/方法對樣本類型的要求。

4.3臨床試驗報告

應對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進行條理分明的描述，并應包括必要的數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法。

4.4其他

如申報產(chǎn)品可適用《用于罕見病防治醫(yī)療器械注冊審查指導原則》，則具體要求可參照該指導原則。

（八）產(chǎn)品技術要求

產(chǎn)品技術要求應符合《辦法》、《44號公告》和《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術要求編寫指導原則》（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號）的相關要求。該類產(chǎn)品作為三類體外診斷試劑，應將主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求等內(nèi)容作為附錄附于技術要求正文后。

如有行業(yè)標準，產(chǎn)品技術要求的相關要求應不低于行業(yè)標準的要求。

（九）產(chǎn)品檢驗報告

根據(jù)《辦法》的要求，第三類體外診斷試劑申請注冊時應提交連續(xù)三個生產(chǎn)批次樣品的檢驗報告。如有適用的國家參考品發(fā)布，產(chǎn)品檢驗應滿足國家參考品的要求。

（十）產(chǎn)品說明書

產(chǎn)品說明書應滿足《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號）的要求，產(chǎn)品說明書的所有內(nèi)容均應與申請人提交的注冊申報資料的相關研究結(jié)果保持一致。下面對該類產(chǎn)品說明書的重點內(nèi)容進行闡述。

1.【預期用途】應至少包括以下幾部分內(nèi)容：

1.1本產(chǎn)品用于體外定性檢測人XX樣本基因組DNA中的遺傳性耳聾基因XX（列舉具體的檢測基因及位點）突變。

1.2本產(chǎn)品用于遺傳性耳聾的輔助診斷。檢測結(jié)果僅代表對患者的遺傳性耳聾相關基因位點的檢測，僅供臨床醫(yī)生參考，不能作為診斷遺傳性耳聾的唯一依據(jù)，臨床醫(yī)生應結(jié)合患者其他診斷信息對檢測結(jié)果進行綜合判斷。

如用于新生兒遺傳性耳聾基因突變的篩查，預期用途可表述為：本產(chǎn)品可用于新生兒遺傳性耳聾基因突變的篩查。其檢測結(jié)果僅代表對新生兒的遺傳性耳聾相關基因位點的檢測，關于新生兒遺傳性耳聾的診斷，應依據(jù)相關的診療流程。

1.3介紹耳聾相關的臨床背景信息及實驗室診斷方法等，介紹被測靶標（突變位點）的相關情況，說明各檢測位點的臨床意義。

2.【檢驗原理】

對試劑盒的技術原理進行詳細介紹，建議結(jié)合適當圖示進行說明。對試劑盒所用探針、引物及突變的判定等進行詳細描述，對不同樣本反應管組合（如涉及）、雜交芯片/雜交膜設計（如涉及）、對照品設置及熒光信號檢測原理等進行說明。

3.【主要組成成分】

3.1說明試劑盒包含組分的名稱或數(shù)量等信息，說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

3.2試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，企業(yè)應列出相關試劑/耗材的名稱及其他相關信息。

3.3如果試劑盒中不包含用于核酸提取純化的試劑組分，則應在此注明經(jīng)過驗證后配合使用的商品化核酸提取純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱以及醫(yī)療器械備案號等詳細信息。

4.【儲存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩(wěn)定性等，應明確具體的儲存條件及有效期等信息。明確開瓶穩(wěn)定性、凍融次數(shù)限制等內(nèi)容。

5.【樣本要求】

樣本的采集、處理、檢測要求、運送和保存：明確樣本采集、核酸提取純化方法、DNA純度及濃度/濃度范圍要求、樣本及核酸提取液的保存要求，包括具體的保存條件及期限等。

6.【適用儀器】

明確經(jīng)驗證的所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關的重要信息以指導用戶操作。

7.【檢驗方法】

詳細說明實驗操作的各個步驟，包括：

7.1實驗條件：實驗室分區(qū)、實驗環(huán)境的溫度、濕度和空調(diào)氣流方向控制等注意事項。

7.2試劑配制方法和注意事項。

7.3詳述核酸提取純化的條件、步驟及注意事項（如適用），對核酸提取純化環(huán)節(jié)進行合理質(zhì)控，應注意需明確提取核酸的濃度及純度等質(zhì)量要求。

7.4擴增反應前準備：加樣體積、順序等。

7.5 PCR各階段的溫度、時間設置、循環(huán)數(shù)設置或相應的自動化檢測程序及相關注意事項。

7.6雜交及顯色體系（如涉及）中各步驟所涉及的反應時間、溫度儀器設置及其他步驟參數(shù)。

7.7最終檢測及結(jié)果判讀過程。

8.【陽性判斷值】

簡要概述陽性判斷值具體判斷標準及研究驗證情況。

9.【檢驗結(jié)果的解釋】

結(jié)合對照品、樣本管/雜交芯片/雜交膜（如涉及）檢測結(jié)果以及檢測類型，以列表/圖片形式詳述所有可能出現(xiàn)的結(jié)果及相應的解釋。如存在檢測灰區(qū)，應詳述對于灰區(qū)結(jié)果的處理方式。

10.【檢驗方法的局限性】

10.1申報產(chǎn)品僅對下述突變位點和突變類型XX進行了驗證。

10.2有關假陰性結(jié)果的可能性分析

10.2.1不合理的樣本采集、運送及處理或核酸過度降解均有可能導致假陰性結(jié)果。

10.2.2未經(jīng)驗證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會導致假陰性結(jié)果（如有）。

10.3該產(chǎn)品不能涵蓋與遺傳性耳聾相關的全部位點，未檢出突變不能排除攜帶其他突變位點。

11.【產(chǎn)品性能指標】根據(jù)分析性能研究資料，編寫概述以下性能指標：

11.1對相應國家參考品（如有）檢測的符合情況。

11.2準確性：簡述研究用樣本、試驗方法和評價結(jié)果。

11.3最低檢測限：簡單介紹最低檢測限的確定方法，并明確最低檢測限結(jié)果，包括線粒體突變最低檢出異質(zhì)性比例。

11.4精密度：簡單介紹精密度的確定方法，并明確精密度結(jié)果。

11.5分析特異性

11.5.1交叉反應驗證：交叉反應驗證情況。

11.5.2干擾物質(zhì)驗證：樣本中常見干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響。

11.6企業(yè)內(nèi)部參考品符合率。

11.7臨床試驗：簡要介紹臨床試驗樣本、試驗方法、所采用的統(tǒng)計學方法及統(tǒng)計分析結(jié)果。

12.【注意事項】應至少包括以下內(nèi)容：

12.1如該產(chǎn)品含有人源或動物源性物質(zhì)，應給出具有潛在感染性的警告。

12.2臨床實驗室應嚴格按照《醫(yī)療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》現(xiàn)行有效版本等有關分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。

三、起草單位

國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術審評中心。